文蛤巨噬细胞迁移抑制因子基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学，具体的说是一种文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因及其编 码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞迀移抑制因子是一种多功能的生物细胞因子，是机体先天免疫应答反应 的重要调节因子。已有的研究表明，巨噬细胞迀移抑制因子在机体的所有组织中广泛表达。 其重组蛋白能够提高机体对细菌感染的抵抗能力。巨噬细胞迀移抑制因子同时具有氧化还 原酶活性和互变异构酶活性。其氧化还原酶活性能够介导激活机体的巨噬细胞和单核细胞 发挥免疫功能，同时消除机体免疫应答过程产生的活性氧；其异构酶活性位点对该蛋白的 细胞因子活性至关重要。巨噬细胞迀移抑制因子参与了动物的免疫应答反应，尤其对于缺 乏获得性免疫的软体动物而言，其作用尤为重要。目前的试验已证明，巨噬细胞迀移抑制因 子参与了光滑双脐螺、中华绒螯蟹以及九孔鲍的免疫应答过程。
[0003] 随着海水养殖业的持续发展，养殖环境污染、病害频发等问题让海水养殖业损失 惨重。传统的利用抗生素的方法控制不仅损害人类的用药资源，同时也不适用于开放的海 水养殖环境，因此开发新的有效的免疫增强剂将成为解决养殖病害问题的途径之一。本发 明源于文蛤本身巨噬细胞迀移抑制因子，是一种天然蛋白，可以作为备选的新型免疫增强 剂。另外，在小鼠中的研究表明重组表达的巨噬细胞迀移抑制因子蛋白能够增强机体对于 细菌感染的抵抗能力。
[0004] 文蛤一种重要的经济养殖贝类，主要分布在我国的东南沿海海域。目前，还没有从 文蛤中获得巨噬细胞迀移抑制因子基因的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因及其编码蛋白和应 用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因，文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因的cDNA 序列为SEQ ID NO. 1中核苷酸所示。
[0008] 所述文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因的cDNA所编码的蛋白为SEQ ID NO. 2中氨 基酸所示。
[0009] -种文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因的应用，所述SEQ ID NO. 1所示文蛤巨噬细 胞迀移抑制因子基因的重组表达产物可作为氧化还原酶或互变异构酶。
[0010] 本发明所具有优点：
[0011]本发明从文蛤EST文库中筛选获得了与巨噬细胞迀移抑制因子基因家族同源的 序列，以此为基础，采用RACE技术以及体外重组表达技术，克隆到文蛤巨噬细胞迀移抑制 因子基因的cDNA全长序列。通过PCR技术，扩增编码文蛤巨噬细胞迀移抑制因子的开放阅 读框序列并将其克隆到pET30a表达载体中，在大肠杆菌中重组表达了该蛋白。重组表达产 物经过HistrapHP亲和柱纯化后，获得了文蛤巨噬细胞迀移抑制因子重组蛋白，经检测此 重组蛋白具有氧化还原酶活性和互变异构酶活性，免疫防御方面发挥着重要作用，可以作 为贝类生长的免疫增强剂及饲料、食品的添加剂等。该蛋白为可溶性表达，具有大规模生产 的可能，可以弥补天然蛋白量低以致难以满足需要的局限。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明实施例纯化的文蛤巨噬细胞迀移抑制因子重组蛋白，其中M:蛋白 marker;1 :0h对照；2:IPTG诱导后 4h;3:IPTG诱导后 12h;4 :纯化所得蛋白；5=Western blot检测蛋白。
[0013] 图2为本发明实施例获得文蛤巨噬细胞迀移抑制因子重组蛋白的氧化还原酶活 性。其中MmMIF为巨噬细胞迀移抑制因子重组蛋白，牛血清蛋白（BSA)为对照蛋白。
[0014] 图3为本发明实施例获得文蛤巨噬细胞迀移抑制因子重组蛋白的互变异构酶活 性。其中MmMIF为巨噬细胞迀移抑制因子重组蛋白，牛血清蛋白（BSA)为对照蛋白。
【具体实施方式】
[0015] 下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。
[0016] 实施例1
[0017] 本发明中的文蛤巨噬细胞迀移抑制因子的cDNA序列克隆包括下列步骤：
[0018] 1)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；
[0019] 2)从文蛤EST文库中筛选获得巨噬细胞迀移抑制因子基因的同源序列；
[0020] 3)RACE扩增获得文蛤巨噬细胞迀移抑制因子的全序列以及全序列的验证。
[0021] 具体操作如下：
[0022] 1.文蛤总RNA的提取：利用Invitrogen公司的Trizol试剂从文蛤幼虫中提取总 RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA纯化试剂盒纯化mRNA。
[0023] 2.文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因cDNA全长序列的克隆：从文蛤EST文 库中选择与巨噬细胞迀移抑制因子基因同源的文蛤EST序列设计5'race引物 (MmMIF5,GSP&MmMIF5'NGS)和 3'race引物（MmMIF3,GSP&MmMIF3'NGSP)，根据race试剂盒 的说明书进行3'和5'末端的扩增。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收 试剂盒（大连宝生物）进行PCR产物的纯化和回收，再与pMD-19-T载体（大连宝生物公司） 链接，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，挑选阳性克隆用载体引物Ml3-47和Ml3-48进 行测序，所得结果经过BioEdit软件拼接，得到文蛤巨噬细胞迀移抑制因子全长序列见SEQ IDNO. 1。所使用的引物序列如下：
[0043] ?长度：114aa
[0044] ?类型：氨基酸序列
[0045] 鲁链型：单链
[0046] 鲁拓扑结构：线性
[0047] (b)分子类型：重组蛋白
[0048] (c)假设：否
[0049] (d)反义：否
[0050] (e)最初来源：NCBI (GenBank:AKN56918. 1)
[0051] (f)特异性名称：文蛤巨噬细胞迀移抑制因子蛋白
[0052]SEQID NO. 1所示文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因，其是从文蛤中克隆得到的巨 噬细胞迀移抑制因子的cDNA序列，该序列全长804bp，其中完整阅读框345bp，5'非编码区 69bp, 3'非编码区390bp，有多聚赖氨酸价位信号（AATAA)和多聚赖氨酸尾巴。该基因在文 蛤先天免疫应答反应中发挥着重要作用，该基因的全长cDNA序列如SEQID NO. 1所示，其 编码的蛋白具有SEQID NO. 2所不的氣基酸序列，完整编码白含有114个氣基酸，包括巨口策 细胞迀移抑制因子蛋白家族保守的功能结构域。
[0053] 3.文蛤巨噬细胞迀移抑制因子基因cDNA全长的验证：在测序拼接的巨噬细胞迀 移抑制因子全长序列上设计一对引物cMmMIFF和cMmMIFR，以cDNA为模板进行全长的验证。 测序以及分析同步骤2.。所使用的引物序列如下：
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