一种酵母生产(s)-三氟苯乙醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到解脂假丝酵母细胞生物催化制备手性 医药中间体（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇的技术。
【背景技术】
[0002] 手性（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊 材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点，作为 绿色高效制备手性化合物的优先途径，被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化 合物。生物催化制备手性（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇具有很好的应用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中，水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来，氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前，采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
[0004] 生物还原法相对于动力学拆分法而言，最大的优势在于理论收率可达100%，原子 经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与，一定程度上限制了其应用。由于 辅酶依赖性的缘故，生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂，实现体内辅酶循环再生的 同时免去了酶的分离纯化步骤。
[0005] (S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌 块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷， 难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇。
【发明内容】
[0006] 本发明采用解脂假丝酵母细胞催化制备（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇，反应式如下：
2, 2, 2-三氟苯乙酮（1)经解脂假丝酵母催化反应，得到产物（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙 醇（2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用解脂假丝酵母作 为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%)均很高。
[0007] 许多解脂假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经 实验，本发明选用解脂假丝酵母菌株为ATCC20688，其催化反应效果最佳。
[0008] 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型，而细胞本身所含有的辅酶量 可能较少，因此，进行氧化还原反应时，为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中 还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同， 效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳 的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：葡萄糖26-30g/L、木糖20-24g/L、异 丙醇7-9%V/V(体积浓度）。
[0009] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
[0010] 培养介质： 1、 种子培养基成份为：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2P04 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉； 2、 培养液成份：：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉 16-20g/L，KH2PO4 4.4-5.5g/L，MgSO4 7H20 0.5-0. 6g/L，pH6. 7。
[0011] 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0012] 解脂假丝酵母细胞制备。解脂假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发 酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至24-25°C，将解脂假丝酵母种子液接种至 发酵罐，接种比例为8-8. 5%，通气比为0. 5-0. 6VAV分钟），24-25°C培养48-54小时，用过 滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0013] 生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6. 3,加入底 物2, 2, 2-三氟苯乙酮，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：单硬脂酸甘油酯含量为 15- 16g/L，葡萄糖26-30g/L、木糖2〇-24g/L、异丙醇7-9%V/V(体积浓度），121 °C高压灭 菌30分钟；冷却至27-28°C时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为82-85g/L，通气比为 0. 12-0. 125V/ (V分钟），进行生物催化反应，反应时间为80-84小时；反应结束后，滤出细 胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物（S)- 2,2,2_三氟苯乙醇，反应转化 率98-99 %，产品收率96-97 %，对映体过量率98. 5-99 %。
[0014] 本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反 应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
[0015] 实施例1 种子培养基成份为：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10,KH2PO4 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉； 培养液成份为：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉 16- 20g/L，KH2PO4 4.4-5.5g/L，MgSO4 7H20 0.5-0. 6g/L，pH6. 7。
[0016] 湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC20688经斜面、摇瓶培 养，得到种子液。IL发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却 至24-25tC，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为接种比例为8-8. 5 %，通气 比为0. 5-0. 6V/ (V分钟），24-25°C培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝 酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0017] 生物催化转化：0. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6. 3,加入 底物2, 2, 2-三氟苯乙酮，使其浓度为80g/L，单硬脂酸甘油酯含量为15g/L，葡萄糖26g/L、 木糖24g/L、异丙醇9%V/V(体积浓度），121°C高压灭菌30分钟；冷却至27-28°C时，加入湿 解脂假丝酵母细胞使其浓度为82g/L，通气比为0. 12V/ (V分钟)，进行生物催化反应，反应 时间为84小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物 (S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇，反应转化率99%，产品收率97%，对映体过量率98. 5%。
[0018] 实施例2 种子培养基成份为：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10,KH2PO4 2g/L，MgSO