一种新的制备稀有人参皂苷的催化体系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及糖基转移酶和蔗 糖合酶的共催化反应体系及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖基化修饰是许多天然产物合成的重要步骤，糖基组成影响天然产物的理化性 质，稳定性和选择性，因而对其生理活性具有重要作用。此外，糖基化修饰还大大增加了天 然产物的多样性，许多天然产物具有相同的苷元结构，但是通过不同的糖基化修饰可以衍 生出多种多样的具有不同生物活性的糖苷化合物。天然产物的糖基化修饰研究在合成生物 学，新药开发等领域具有重要前景。
[0003] 自然界中，糖基化修饰通过糖基转移酶（glycosyltransferaseGT) (EC2. 4.I.X) 完成，根据CAZy数据库GT可以划分为94个家族，一般来说催化小分子化合物糖基化的GT 都属于GTl家族，这是CAZy数据库中最大的一个糖基转移酶家族。GT的功能是把活化的糖 基供体上的糖基转到糖基受体的羟基或者羧基上（也可能是巯基或者氨基）。GT催化的糖 基化反应所能利用的糖基供体是核苷二磷酸-糖，例如尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖、UDP-半 乳糖，和UDP-葡萄糖醛酸等。利用GT对天然产物进行特异性糖基化修饰一方面可以合成 某些重要糖苷类化合物，另一方面可以对药物进行改造提高其药效或者用于开发新药。例 如ThorsonJS研究组研究人员通过体外/体内糖基化修饰改造万古霉素，获得了一系列具 有更高抗菌活性的万古霉素糖苷化合物，这些新的化合物可作为更好的抗菌新药（Nature biotechnology2003 ;21:1467-1469)。
[0004] 人参皂苷是从人参及其同属植物（如三七、西洋参等）中分离到的皂苷的总称，是 人参中的主要有效成份。人参阜苷为三廠类化合物，是由四环三廠型苷元（原人参二醇或 原人参三醇）或五环三萜型苷元（齐墩果酸）经不同的糖基化修饰的衍生物。稀有人参皂 苷的糖修饰程度一般都比较低（只含有1-2个糖基），而丰富皂苷的糖基化修饰程度较高 (含有由各个糖基组成的糖链）。所以传统的生产稀有人参皂苷的方法是以人参或者三七 总皂苷或者丰富皂苷为原料，通过化学水解法、酶水解法和微生物发酵水解法来生产稀有 人参皂苷。化学水解法由于反应条件剧烈，难于控制，专一性差，副产物多，近年来已经很少 使用。酶水解和微生物发酵水解都是基于糖苷酶作用水解人参皂苷糖基，虽然相比于化学 方法，其专一性提高，但是对于人参皂苷C3,C6,C20糖链水解特异性并不是很高，水解程度 也需要控制，水解产物可能为多种皂苷的混合物。
[0005] 此外，在体外利用GT催化小分子化合物糖基化修饰所面临的最主要问题是GT所 能利用的糖基供体为核苷二磷酸（UDP)-糖，而这类化合物通常没有商业化，某些有商业化 的化合物如UDP-葡萄糖，价格又非常昂贵（Ig约需4000RMB)。这一点极大的限制了利用 GT合成糖苷的应用。
[0006] 因此，本领域迫切需要开发一种能够经济、高效合成稀有人参皂苷的产业化反应 体系制备方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种利用糖基转移酶与蔗糖合酶的体外共催化反应体系 制备多种稀有人参皂苷的方法及其应用，特别是高效低成本的人参皂苷CompoundK、人参 皂苷Rh2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rhl和人参皂苷Fl的体外反应制备方法。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种制备稀有人参皂苷的共催化反应体系，所述的 共催化反应体系包括：
[0009] (a)糖基转移酶（glycosyltransferase GT);
[0010] (b)鹿糖合酶（sucrose synthase SUS);
[0011] (c)核苷二磷酸（UDP);和
[0012] ⑷蔗糖。
[0013] 在另一优选例中，所述的糖基转移酶可以为一个或多个。
[0014] 在另一优选例中，所述的蔗糖合酶可以为一个或多个。
[0015] 在另一优选例中，所述的共催化反应体系还包括：
[0016](e)任选的人参的次生代谢产物，较佳地，为原人参二醇或原人参三醇。
[0017] 在另一优选例中，所述的共催化反应体系不含添加的UDP-葡萄糖。
[0018] 在另一优选例中，所述（a)_(d)中的1个、2个、3个、或4个可为独立未混合形式 或任意组合的混合形式。
[0019] 在另一优选例中，所述的共催化反应体系含有两种糖基转移酶和一种蔗糖合酶。
[0020] 在另一优选例中，所述的糖基转移酶来源于人参、三七、西洋参、苜蓿；和/或
[0021] 所述的蔗糖合酶来源于马铃薯、拟南芥、甘薯、木薯、或大豆，较佳地，为马铃薯、大 豆。
[0022] 在另一优选例中，所述的糖基转移酶来源于人参。
[0023] 在另一优选例中，所述的蔗糖合酶来源于马铃薯。
[0024] 在另一优选例中，所述的原人参二醇的结构式如式I所示。
[0025]
[0026] 在另一优选例中，所述的原人参三醇的结构式如式II所示。
[0027]
[0028] 在另一优选例中，所述糖基转移酶和蔗糖合酶的比例为1-5 :0. 5-2 (wt);和/或
[0029] 所述UDP:蔗糖的比例为l-10:10(wt)。
[0030] 在另一优选例中，所述的UDP浓度为0.05-0. 5mM;和/或所述的蔗糖浓度为 300_500mM〇
[0031] 在另一优选例中，所述的糖基转移酶包括一种或多种选自SEQIDNO. :31-35所示 的多肽；和/或
[0032] 所述的蔗糖合酶选自SEQIDNO. :36-38的多肽。
[0033] 在另一优选例中，所述的稀有人参皂苷包括人参皂苷compoundK、人参皂苷Rh2、 人参皂苷Fl、人参皂苷Rhl和人参皂苷Rg3。
[0034] 本发明第二方面，提供了一种酶组合或其编码基因的用途，用于制备产生稀有人 参皂苷的（i)试剂；（ii)本发明第一方面所述的共催化反应体系；（iii)工程菌株，其中， 所述的酶组合由糖基转移酶和蔗糖合酶构成，
[0035] 本发明第三方面，提供了一种分离的多核苷酸组合，所述的多核苷酸组合中的多 核苷酸分别编码（i)人参来源的糖基转移酶，和（ii)蔗糖合酶。
[0036] 在另一优选例中，所述的多核苷酸如SEQIDNO. : 1-6,和SEQIDNO. :39-40所 示，其中，SEQIDNO. : 1-6所示的序列分别编码SEQIDNO. :31-36所示的蛋白，SEQID NO. :39-40所示的序列分别编码SEQIDNO. :37-38所示的蛋白。
[0037] 在另一优选例中，所不的多核苷酸组合用于制备生产稀有人参阜苷的工程菌株或 试剂盒。
[0038] 本发明第四方面，提供了一种载体，所述的载体用于表达（i)人参来源的糖基转 移酶，和/或（ii)蔗糖合酶；
[0039] 其中，所述的载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸组合，和/或
[0040] 所述的载体分别含有本发明第三方面所述多核苷酸组合中的一种或多种多核苷 酸。
[0041] 在另一优选例中，所述的载体分别含有SEQIDNO. : 1-6, 39-40所示的核苷酸序 列。
[0042] 本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所 述的载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有本发明第三方面所述的多核苷酸组合。
[0043] 本发明第六方面，提供了本发明第一方面所述的共催化反应体系的用途，用于催 化原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷。
[0044] 本发明第七方面，提供了一种制备稀有人参皂苷的方法，在本发明第一方面所述 共催化反应体系的存在下，将原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷；或
[0045]本发明第一方面中（a)、（b)、（c)、和（d)的共同存在下，将原人参二醇或原人参三 醇转化为稀有人参皂苷。
[0046]在另一优选例中，所述的（a)、(b)存在于发酵体系中，和/或所述的（a)、(b)以固 定化酶形式存在。
[0047] 本发明第七方面，提供了一种制备人参稀有皂苷的方法，所述的方法包括如下反 应：
[0048]
[0049] 当X为原人参二醇；Y为原人参二醇型皂苷，例如人参皂苷CK，Rh2,Rg3 ;
[0050]当X为原人参三醇；Y为原人参三醇型皂苷，例如人参皂苷Fl，Rhl，Rgl;
[0051]其中，X:UDP= 1:0. 05-5,较佳地，为 1:0. 5-2;
[0052]X:蔗糖=I:600-1000,较佳地，为I:800 :900。
[0053] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0054] 图 1、A-F分别为六对引物SEQIDN0:7/8、SEQIDN0:9/10、SEQIDN0:10/ll、 SEQIDNO: 12/13、SEQIDNO: 14/15 和SEQIDNO: 16/17 的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检 测结果。
[0055]图 2A1-A5 为大肠杆菌中表达UGTPgl、UGTPg5、UGTPg29、UGTPg50 和BClO的 SDS-PAGE和westernbolt图（左SDS-PAGE，右westernbolt，第 1 泳道上清，第 2 泳道沉 淀，第1泳道总蛋白）；图2B为蔗糖合酶SUSl在酿酒酵母中表达SDS-PAGE(左：第1泳道 marker,第2泳道SUSl粗酶液，第3泳道SUS初步纯化酶液）和westernbolt(右）图。 [0056]图3、蔗糖合酶SUSl与糖基转移酶UGTPgl联合催化原人参二醇薄层层析检测结果 (A)和HPLC结果（B)。
[0057]图4、蔗糖合酶SUSl与糖基转移酶UGTPgl联合催化原人参三醇薄层层析检测结果 (A)和HPLC结果（B)。
[0058]图5、蔗糖合酶SUSl与糖基转移酶UGTPg5联合催化原人参三醇薄层层析检测结果 (A)和HPLC结果（B)。
[0059]图6、蔗糖合酶SUSl与糖基转移酶UGTPg50联合催化原人参二醇薄层层析检测结 果㈧和HPLC结果（B)。
[0060]图7、蔗糖合酶SUSl与糖基转移酶UGTPg50和UGTPg29化原人参二醇薄层层析检 测结果（A)和HPLC结果（B)。
[0061]图8、蔗糖合酶SUSl与糖基转移酶BClO催化原人参二醇薄层层析检测结果。（A) 和HPLC结果（B)。
[0062]图9、蔗糖合酶AtSUS/GmSUS与糖基转移酶UGTPgl催化原人参三醇的TLC和HPLC结果；图9A和B分别为AtSUS/GmSUS。
【具体实施方式】
[0063] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了，由糖基转移酶和蔗糖合酶 构成的酶组合，在蔗糖和少量UDP存在的条件下，能够取代现有技术中水解去糖基的稀有 人参皂苷，并替代体外反应体系合成稀有人参皂苷的昂贵原料之一UDP-糖，高效、经济地 将原人参二醇或原人参三醇等底物转化为稀有人参皂苷，其中，UDP的价格仅约为UDP-糖 的1/4,且其用量也为原先的1%，从而很大程度上地节省了稀有人参皂苷的制备成本，更 有利于人参皂苷的大规模商业制备。此外，实验还进一步证明，多种植物来源的糖基转移酶 和蔗糖合酶均能够产生该有益效果。在此基础上，完成了本发明。
[0064] 糖基转移酶（GT)
[0065] 自然界中，糖基化修饰通过糖基转移酶（glycosyltransferaseGT) (EC2. 4.I.X) 完成，根据CAZy数据库GT可以划分为94个家族，一般来说催化小分子化合物糖基化的GT 都属于GTl家族，这是CAZy数据库中最大的一个糖基转移酶家族。GT的功能是把活化的糖 基供体上的糖基转到糖基受体的羟基或者羧基上（也可能是巯基或者氨基）。GT催化的糖 基化反应所能利用的糖基供体是核苷二磷酸-糖，例如尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖、UDP-半 乳糖，和UDP-葡萄糖醛酸等。利用GT对天然产物进行特异性糖基化修饰一方面可以合成 某些重要糖苷类化合物，另一方面可以对药物进行改造提高其药效或者用于开发新药。例 如ThorsonJS研究组研究人员通过体外/体内糖基化修饰改造万古霉素，获得了一系列具 有更高抗菌活性的万古霉素糖苷化合物，这些新的化合物可作为更好的抗菌新药（Nature biotechnology2003 ;21:1467-1469)。
[0066] 可用于本发明的糖基转移酶没有特别限制，可以为各种植物来源的具有利用糖基 供体将其糖基转移到底物的羟基或羧基等基团上合成糖苷类化合物功能的糖基转移酶。例 如，本发明糖基转移酶可对植物的小分子代谢产物进行糖基化进行修饰，优选地，所述的小 分子代谢产物可以是原人参