Pdgfra基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种突变检测试剂盒，特别涉及一种TOGFRA多点突变单管快速检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 血小板源性生长因子受体（Platelet-derivedgrowthfactorreceptor，F1DGFR) 是TOGFR信号转导通路中的重要成员，包括TOGFRalpha和TOGFRbeta两种，在促进肿瘤 细胞的增殖、侵袭、及新生血管形成等方面起重要作用，PDGFRA基因突变主要见于胃肠道 间质瘤（GIST)，因此常作为GIST诊断的参考指标。
[0003] 胃肠道间质瘤（gastrointestinaIstromaltumor,GIST)是消化道最常见的 间叶性肿瘤，也是肿瘤生物靶向治疗中的典范。胃肠道间质瘤起源于胃肠道卡哈尔间质细 胞（interstitialcellofCajal,ICC)或向ICC分化的原始间充质细胞。
[0004] 酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼（格列卫）可选择性抑制ablAbl-Berc-kit及 I3DGFR的激酶活性。近年来，格列卫成为治疗GIST有效的分子靶向药物(尤其是手术不能 切除或转移、复发病例）。I3DGFRA基因突变位点对预测药物疗效有积极作用。研究结果表 明，对于KIT基因无突变的GIST患者，还需要检测有无TOGFRA基因是否存在激活性突变， 因为TOGFR的突变主要发生在没有KIT突变的肿瘤中，目前常检测两种突变类型外显子12 (3%)，外显子18(9.7%)，其中I3DGFRA第18外显子D842V发生突变的GIST病例对格列卫、 舒尼替尼治疗原发耐药。I3DGFRA第18外显子63%为D842V突变，多仅限于胃和大网膜，其 次为缺失突变，主要为D頂H842-845del和頂HD843-846del，占整个I3DGFRA突变的14.9%。
[0005]I3DGFRA基因药物敏感的突变点，目前普遍认为需检测4个突变位点，市面上的荧 光PCR检测试剂盒普遍使用单管一点进行检测，分析过程繁琐而且没有必要。
[0006] 本专利使用多点突变并行检测技术，在单管中，可通过荧光基团的指示作用，在同 一个PCR反应中，即可同时检测出多个突变位点。不需分开几个PCR管分别进行。实现简 单，方便的I3DGFRA点突变检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种高效的TOGFRA多点突变单管快速检测方法及试剂 盒。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤： 1) 设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探 针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分 与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补； 2) 将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热 启动快速Taq酶系统混合，扩增； 3)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。
[0009] 作为上述方法的进一步改进，ARMS引物对应的下游引物、中介连接引物、通用荧 光探针应为简并的，即一条下游引物、中介连接引物、通用荧光探针可以对应于多条。
[0010] 作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针 上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过4个核苷酸，进一步的，不超过3个、 2个、1个或连接在相互配对的两个核苷酸上。
[0011] 作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的 核酸数量不少于l〇bp，特别的，互补的核酸数量为15~30bp。
[0012] 作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对 的核酸数量不少于l〇bp，特别的，互补的核酸数量为15~45bp。
[0013] 互补序列的存在，有利于保证引物间存在足够的亲和力，保证检测结果的可靠性。
[0014] 作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。保护序 列的作用在于防止探针的关键序列不被反应体系中无意引入的核酸外切酶过早切除。保护 序列不与待测序列、引物等互补配对，可以是简单重复序列，如多个A、T、C、G等。
[0015] -种I3DGFRA多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，热启动快速Taq酶 系统和I3DGFRA突变检测引物，其特征在于：所述TOGFRA突变检测引物由多组ARMS引物及 对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针组成；其中：中介连接引物的 一端序列与待TOGFRA突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与通用荧光探针部分核 酸互补配对。
[0016] 优选的，上述I3DGFRA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与 TOGFRA突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为 15 ~30bp〇
[0017] 优选的，上述I3DGFRA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中 与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为 15 ~45bp〇
[0018] 特别的，上述I3DGFRA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的ARMS引物的序列如 下：
[0019] 热启动快速Taq酶系统的组成为dNTPS(U)、UNG酶、热启动快速Taq酶。
[0020] 本发明的有益效果是： 1) 本发明操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引 物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本。
[0021] 2)本发明检测方法克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量。
[0022] 3)本发明的检测方法实现了多管检测反应的简易性，1管反应取代了之前的多管 检测，节省人力物力。
[0023] 4)本发明的检测方法中使用快速Taq酶，比普通Taq酶更好。
【附图说明】
[0024] 图1到图6是本发明检测方法的原理图； 图7是等浓度模板在不同Taq酶反应条件下的PCR扩增曲