Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于癌症预后技术领域，具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌 预后制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝内胆管细胞癌（intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)也称周围型肝内胆管 癌或胆管细胞癌，原发于肝内二级以上胆管黏膜上皮细胞，是胆道系统最常见的恶性肿瘤 之一。近几年ICC发病率在全球范围内仍呈增长趋势。其中我国胆管癌患病人数占全球胆 管癌患者的55%。ICC恶性程度高，具有极强的侵袭和淋巴结转移特性，通常预后非常差， 平均5年生存率为30%。相关研究显示，对于不可行手术切除的患者5年生存率〈5%。当 前手术切除是肝内胆管细胞癌早期最主要的治疗方式，也是唯一可能的治愈方式，然而其 术后复发率也高达50%。化疗（如顺铂+吉西他滨）通常不理想，以5-FU和吉西他滨为主 的治疗方式部分缓解率仅为20~30%。尽管已有研究发现ICC中可见某些基因如KRAS、 PIK3CA、MET、EGFR、BRAF、NRAS和IDH等的异常表达，但ICC的发生发展、侵袭转移和血管生 成等分子机制仍未十分明确。更好的了解ICC生物学行为的分子机制对于改善ICC患者的 预后至关重要。
[0003] Sall4是一个与多种肿瘤发病密切相关的原癌基因：Sall4基因最早在胚胎干细 胞发现存在中高表达，对维持胚胎干细胞的多能性和自我更新具有重要作用，而且表达水 平与细胞周期的进程显著相关。近年又有多项研究表明，Sall4可能与多种肿瘤（如肺癌、 胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌和淋巴瘤）的发生发展有着密切的关系 [11'14 22]。尽管目 前已有人研究过Sall4与肝细胞性肝癌的相关性，10%~20%的肝癌患者表达高水平的 3八1^4，但是50%的患者表达低水平的341^4。但迄今为止，对3 &114与1〇：的相关性还所 知甚少。肝细胞性肝癌和肝内胆管细胞癌同属于原发性肝癌，但是二者无论在细胞起源、组 织学发生和生物学行为方面，还是在临床病理学特点、治疗策略以及临床预后等方面均不 相同。那么，Sall4是否可能也参与了ICC的发生和发展，并有可能与患者的预后存在一定 的相关性呢？为此，本发明设计了一系列预实验，收集了 175例不同年龄、不同性别和不同 肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从 Sal14表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面，对Sal14在ICC中的作用做了初步探 讨。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种肝内胆管细胞癌预后的标志物，以及该标志物在制备该 种癌症预后和干扰制剂中的应用。
[0005] Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用，所述的Sall4基因序列如 SEQ:NO. 1 所示。
[0006] Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预 后的制剂。通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-I信号途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和 转移。
[0007]Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移预后的制剂。通过 Sal14的表达控制E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白的表达，从而调控肝内胆管细胞癌的癌细 胞的远处转移。
[0008] 预后制剂包括：划痕实验检测、Transwell实验检测、Westernblot检测、石錯组 织芯片检测、PCR检测、原位杂交检测制剂。
[0009] PCR检测试剂引物序列如下：
[0010]正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG
[0011] 逆向引物：CAITCCCTGGGTGGITCACTG。
[0012] Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌复发和转移的制剂的应用，通过Sall4 基因序列设计用于下调肝内胆管细胞癌的癌细胞中Sall4表达的干扰RNA，所述的Sall4基 因序列如SEQ:NO. 1所示。
[0013]Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌淋巴转移、血管浸润和神经浸润的制剂。
[0014]Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移的制剂。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 1、为临床判断肝内胆管癌的预后提供基因分型基础；
[0017] 2、改善肝内胆管癌患者的预后。
【附图说明】
[0018] 图I:Sall4在癌组织、癌旁组织和正常肝内胆管组织中的表达；
[0019]ICC表示ICC病灶组织样本，Per表示与之前ICC病灶组织相对应的癌旁组织样 本，Con表示正常肝内胆管组织样本；
[0020] 图2 :Kaplan_Meier总体生存分析结果；
[0021] 图3:划痕实验结果；
[0022] 图 4:Transwell实验结果；
[0023] 图5 :E_f丐黏连蛋白和N-f丐黏连蛋白表达的Westernblot结果；
[0024]图 6:PTEN和Bim-1 蛋白表达的Westernblot结果。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0026] 实施例
[0027] (一）PCR检测
[0028]正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG
[0029]逆向引物：CAITCCCTGGGTGGITCACTG。
[0030] 操作步骤
[0031] 1 ?提取细胞DNA
[0032]2?反应程序：
[0033]
[0034] 将反应试剂加入EP管中
[0035] 轻混后用IOOul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过 程中蒸
[0036] 发，盖好盖子
[0037] 打开PCR反应仪输入以下反应数据
[0038] ? 94°C预变性5min
[0039] ?McC变性40s
[0040] #40 cC退火40 s
[0041] ? 72°C延伸Imin
[0042] 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸IOmin
[0043](二）划痕实验：在6孔板种入大约5 X IO5个细胞（以过夜能铺满为宜），第二天 用枪头比直横线划痕。PBS洗细胞3次去除划下的细胞。加入无血清DMEM高糖培养基，于 37°C 5% CO2培养箱培养。按0,6,12, 24小时取样拍照；
[0044](三）侵袭实验：用融化的Matrigel原液和预冷无血清DMEM高糖培养液配制 0? 8 y g/ y I Transwell chamber上室凝胶液，以每孔100 y 1包被Transwell上室，37°C培 养箱中放置2小时使其成固化胶，制成侵袭小室。胰酶消化实验细胞并收集计数，用无血清 DMEM高糖培养基稀释成IXIOfVml细胞悬液，每孔Transwell上室加入100y1细胞悬液， 下室加入600 y 1含10 % FBS的完全DMEM培养基，置于培养箱培养36h~48h。从双室培 养板中取出Transwell小室，吸弃液体，用棉签檫净基底膜胶，PBS漂洗后立即4%甲醛固定 15分钟，PBS漂洗2~3次后用Giemsa染色30分钟，清水洗去染液后于200倍镜下观察， 选取上中下左右5个视野计数并拍照；
[0045](四）Western blot实验
[0046] 1.设备和试剂
[0047]1)设备：电泳电源（BIO-RAD，#165-3323)、电泳仪及附件（BIO-RAD，）、电转仪及附 件（BI0-RAD，#170-3930)、NC膜（PIERCE，）、滤纸（Whatman, 3MMCHR)
[0048]2)凝胶试剂组成：30 %丙烯酰胺溶液、10 %过硫酸铵、TEMED(上海生工）、 Tris-Base^ 10%SDS(SIGMA)
[0049] 3)蛋白提取配制试剂：
[0050] 总蛋白提取试剂（组织/细胞裂解试剂，RIPA裂解液）组成：1%NP-40、0.1% SDS、50mMDTT，使用前加入蛋白酶抑制剂 2ug/mlAprotinin、2ug/mlLeupeptin和ImM PMSF0
[0051] 4)常用溶液及缓冲液
[0052]A. 5 %积层胶所用溶液
[0053] 按总体积2. 5ml:
[0054] ddH20：1. 7ml
[0055] 30%丙烯酰胺溶液：0? 42ml
[0056]I.Omol/LTris(PH= 6. 8) ：0. 315ml
[0057] 10%SDS：25ul
[0058] 10%过硫酸铵：25ul
[0059]TEMED：3ul
[0060] B.电泳缓冲液，IL
[0061]3g Tris-Base、14. 4g甘氨酸、Ig SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8. 3左右。也可 以制成IOX的储存液，在室温下长期保存。
[0062]C?电泳转移缓冲液，IL
[0063] 3gTris_Base、14. 4g甘氨酸、甲醇200ml,加蒸馏水至1L,也可以制成IOX的储 存液，在湿温下长期保存。
[0064]D. 5X样品缓冲液，IOml
[0065] 0.6mllmol/L的Tris-HCl(Ph6. 8)、5ml50 % 的甘油、2ml10 % 的SDS、0. 5ml 2-巯基乙醇、ImlI%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4°C保存数周，或在_20°C保存数月。 [0066] 2.蛋白提取（根据样品及检测要求选取以下适当提取方法）
[0067]B-L细胞裂解提取总蛋白（采用RIPA裂解液）
[0068] 1).细胞收集好，加入Iml总蛋白提取液，充分吹打，然后冰上放置10~20minmin 后，再吹5min~20min,将勾衆液吸出放到I. 5ml离心管中。
[0069] 2)?超声3次，每次3s。
[0070] 3) ? 9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的I. 5ml离心管中。
[0071] 4) .-20cC冻存。
[0072]A-1.组织裂解提取总蛋白（米用TotalproteinExtractionKit，ProMab,Cat. No：SJ-200501)
[0073] I).用剪刀剪取约0? 5mg组织，置于组织匀浆器中，加入Iml总蛋白提取液，匀浆 5min~20min直到组织充分破碎，然后冰上放置10~20min后，再勾衆5min~20min,将 匀浆液吸出放到I. 5ml离心管中。
[0074]2)?超声3次，每次3s。
[0075] 3) ?9000rpm，离心lOmin，取适量上清置于新的I.5ml离心管中
[0076] 4) .-20cC冻存。
[0077] 3.SDS-PAGE电泳
[0078] 1) ?将抗原（组织/细胞裂解液）样品体积：5Xloading buffer体积=5:1，混 勾，在100°C加热三分钟以使蛋白质变性。
[0079] 2).设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样，每个电泳道加样体积为 10-20y1;电压200V开始电泳，待溴酚蓝迀移到分离胶底部0. 5cm处，关闭电源。
[0080] 3).从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。
[0081] 4.免疫印迹操作-转膜
[0082] 1).将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15_20min.。
[0083] 2).带上手套，裁剪好滤纸（Whatman, 3丽C