用于治疗糖尿病相关并发症的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 本申请遵照美国专利法第35条第119款（e)项的规定要求于2013年1月30日 提交的美国临时申请No. 61/758, 511的权益。通过引用将上述申请并入本文。
[0002] 本发明是遵照美国国立卫生研究院授予的批准号为R01HL085061的文件而在政 府支持下进行的。政府在本发明中拥有某些权益。
技术领域
[0003] 本发明涉及糖尿病领域，具体地，公开了用于抑制、治疗和/或预防糖尿病相关病 症/并发症的组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 整个说明书引用一些出版物和专利文献，来描述本发明所属领域的技术现状。通 过引用犹如全文阐述般将这些引文中的每一个并入本文。
[0005] 对于美国超过130万患有I型糖尿病（TlD)的个体，可以采用不同持续时间胰岛 素、胰岛素递送栗、葡萄糖监测设备、食物管理以及运动策略将血糖维持在接近生理水平。 这种多管齐下的方法在最近30年内在以下几方面已经取得了一些成绩：减少了包括失明、 肾衰竭、糖尿病性心肌病/心力衰竭、勃起功能障碍以及中风在内的已知心血管并发症的 发生率，并且使患有TlD个体的预期寿命增加超过15岁至±69岁。遗憾的是，寿命的增加 也暴露了与TlD相关的更新的伴随疾病，包括认知障碍。后者早在TlD发病后的±10-15 年就已出现，表现为信息处理速度、精神运动功能、认知灵活性、视觉感知和注意力等方面 的减退。有趣的是，学习和记忆能力不受影响。来自糖尿病控制和并发症临床试验（DCCT) 和糖尿病干预和并发症流行病学（EDIC)研究组以及其他研究组的最新数据表明，整体认 知功能的降低与低血糖事件无关，但与微血管并发症的程度关系密切。引发脑微血管病的 内在分子以及预防或减缓其发展的治疗策略仍不明确。目前，有9类FDA批准的药物可用 于整体降糖。然而，没有特异靶向于糖尿病心血管并发症的FDA批准药物。因此，很明显， 仍然需要用于治疗糖尿病并发症的新的有效治疗方法。
【发明内容】
[0006] 根据本发明，提供了用于治疗、抑制和/或预防受试者中以丙酮醛的过表达为特 征的疾病或病症的方法。在一个特定的实施方案中，本发明的方法包括对需要其的受试者 施用编码丙酮醛降解酶（例如乙二醛酶-1)的核酸分子。在一个特定的实施方案中，由丙酮 醛的过表达表征的疾病或病症为糖尿病、糖尿病相关并发症或血管疾病。可将在载体尤其 是病毒载体中的编码丙酮醛降解酶的核酸分子施用于受试者。编码丙酮醛降解酶的核酸分 子可以可操作地连接至内皮细胞启动子或平滑肌细胞启动子。在一个特定的实施方案中， 编码丙酮醛降解酶的核酸分子可操作地连接至内皮素-1启动子。在一个特定的实施方案 中，所述病毒载体为腺相关病毒载体。
【附图说明】
[0007] 图IA提供了在指明的治疗后对照组大鼠或链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠（起 始体重为约220g)的体重（上）和血糖水平（下）随时间的变化曲线图。图IB提供了在 指明的治疗后对照组大鼠或链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠（起始体重约为275g)的体重 (上）和血糖水平（下）随时间的变化曲线图。
[0008] 图2A提供了对照组雄性和雌性2型糖尿病小鼠（瘦素受体缺陷）或注射 AAV2/9-End 〇Gl〇-l的小鼠的体重随时间的变化曲线图。图2B提供了对照组雄性和雌性2 型糖尿病小鼠（瘦素受体缺陷）或注射AAV2/9-End 〇Gl〇-l的小鼠的血糖水平随时间的变 化曲线图。
[0009] 图3提供了在指明的治疗后对照组大鼠或链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠的嵌套 评分（nesting score)图。
[0010] 图4A和图4B示出了在指明的治疗后链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠的微血管舒 张百分比。图4A示出了内皮依赖性舒张，图4B示出了平滑肌依赖性舒张。
[0011] 图5A提供了对照组大鼠、链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠或用AAV2/9End〇-Gl〇-l 治疗的链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠的大脑皮层血管渗漏、大脑海马和丘脑图像。图5B 提供了在指明的治疗后对照组大鼠或1型糖尿病大鼠的大脑毛细血管灌注图。
[0012] 图6A提供了对照组大鼠的微血管内皮免疫组织化学图像。图6B提供了 I型糖尿 病大鼠的微血管内皮免疫组织化学图像。图6C提供了用AAV2/9-End〇-Gl〇l治疗的I型糖 尿病大鼠的微血管内皮免疫组织化学图像。
[0013] 图7提供了随着丙酮醛浓度的增加，人脑微血管内皮细胞（上）、人脑微血管平滑 肌细胞（中）和人星形胶质细胞（下）的细胞活力百分比图。
[0014] 图8A提供了输入-输出响应的初始斜率，图8B提供了来自对照组大鼠、I型糖尿 病大鼠和用AAV 2/9-Endo-Glol治疗的I型糖尿病大鼠的海马体切片中突触传递的双脉冲 比值。
[0015] 图9提供了急性缺血再灌注损伤后大鼠的脑图像（上）和梗死面积图（下）。在 本研究中使用了对照组大鼠、I型糖尿病大鼠、用AAV 2/9-Endo-Glol治疗的I型糖尿病大 鼠和用AAV 2/9-Glol (缺乏内皮细胞启动子）治疗的I型糖尿病大鼠。
[0016] 图10提供了相位影像（左列）和检测来自对照组大鼠（上）、1型糖尿病大鼠（中 间）、用AAV 2/9-Endo-Glol治疗的I型糖尿病大鼠（下）的肾脏切片的异硫氰酸荧光素标 记牛血清白蛋白（BAS-FITC)(右列）的图像。
【具体实施方式】
[0017] 目前，对于与糖尿病相关的心血管并发症如心力衰竭（心肌病）、肾衰竭、视网膜 病变和神经病变的管理是一项重大医疗保健挑战。当前策略采用改变生活方式（例如，多 运动和食物管理）、胰岛素和其他降糖药物相结合。还使用降血脂和抗高血压药物来控制 混杂因素。遗憾的是，目前的策略往往是：利用最近诊断的患有1型和2型糖尿病的年轻个 体比用患有慢性和/或长期糖尿病的个体得出更有利的结果。此外，由于担心出现低血糖 (症状严重时，低血糖的处理更具挑战性），所以不可能在所有患者中实现降低并发症所需 的血糖控制水平。随着患有糖尿病的个体的预期寿命继续增加，显露出额外的并发症，包括 最近发现的认知功能下降。
[0018] 内皮是脑血管内腔中的高度特化的单层细胞，通过合成和释放血管舒张物质（例 如，一氧化氮）和血管收缩物质（例如，血栓素A)调节血管张力和血流。内皮细胞（EC)也 是血脑屏障不可或缺的组分。EC的损伤/紊乱是包括阿尔茨海默氏病和中风在内的许多脑 血管疾病的确定原因。内皮功能紊乱也可能是患有TlD的个体认知能力减退的潜在原因。 虽然高血糖作为催化剂，但是葡萄糖本身不是导致内皮功能紊乱的原因。由高血糖导致的 新陈代谢和细胞生物化学的变化产生的活性氧类物质和炎症介质被认为是主要的候选因 素。
[0019] 微血管是运输营养物质和消除废物的器官内的小血管系统。这些血管中最小的叫 做毛细血管。小动脉和小动脉分支将营养物质运输至毛细血管，并且小静脉将废物从毛细 血管运输出去。微血管腔内为单层特化细胞，统称为内皮。这些细胞合成调节血管张力、凝 血和炎症的化学物质并将其释放至这些细胞的微环境中。终末器官内用于局部控制血流、 血压和营养物质递送/废物排出所需的微血管的动态血管张力由响应由EC分泌的物质的 3-5层平滑肌细胞（SMC)的行为决定。在TlD中，EC合成和/或分泌这些血管调节因子的 能力减弱，并且这种缺陷可能是引发终末器官功能障碍的原因。体内合成的最强有力的"内 皮损伤"物质之一是丙酮醛，并且其产生在TlD中上调。
[0020] 高血糖增加了两组细胞氧化剂（活性氧类物质（ROS)和活性羰基类物质（RCS)) 的产生。通过激活NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶以及线粒体电子传递链的复合物I和III 产生前体R0S、超氧阴离子02 ? _。这些物种通过与主要的血管舒张因子一氧化氮（NO)反 应和减少主要的血管舒张因子一氧化氮（NO)来损害内皮功能。然而，使用抗氧化剂（包括 维生素C、维生素E和(6-胡萝卜素）进行治疗的临床研究表明，对患有糖尿病个体的心血 管功能仅有最低限度的改善。对这些临床数据的一种解释是02 或其代谢物（0H、H0C1、 H202)不是心血管功能障碍的引发因素，而是由上游过程产生的次要结果。
[0021] 活性羰基类物质（RCS)为小的、亲电子、单羰基或二羰基物种，包括但不限于丙烯 醛、N-羧基（甲基）赖氨酸、N-羧基（乙基）赖氨酸3-脱氧葡萄糖酮醛、乙二醛（GO)、咪 唑啉酮、4-羟基壬烯醛、精氨嘧啶、丙二醛和丙酮醛（MG)。这些物种由多种来源产生，包括 葡萄糖的自氧化和葡萄糖、脂质和蛋白质的酶促降解。RCS不是功能上良性的代谢副产品， 然而，它们调节重要的细胞和生理过程，包括细胞生长、分化、增殖、凋亡和睡眠。RCS不带 电，与ROS (毫秒）相比具有更长的半衰期（数分钟至数小时），这允许它们迀移并在远离 其产生地的位置发挥它们的作用。RCS最著名的效应是它们与蛋白质上的碱性氨基酸残基 反应形成羰基加合物的能力，所述羰基加合物包括晚期糖基化终末产物（AGEs)和晚期脂 质过氧化终产物（ALEs)。RCS还可以激活晚期糖基化终产物（RAGEs)的膜结合受体，引发 促炎细胞因子、趋化因子和粘附分子的产生以及增加氧化应激和细胞凋亡。RCS的细胞水 平受到几种RCS降解酶的严格调控，所述RCS降解酶包括谷胱甘肽硫转移酶（hGSTA4-4和 hGST5. 8)、醛糖还原酶、乙醛脱氢酶和乙二醛酶。在TlD中，RCS和RCS降解酶的产生上调。 然而，产生的RCS的量超过RCS降解酶的能力，产生可以与蛋白质上的易感碱性氨基酸残基 发生不可逆反应的"游离的RCS"，从而改变它们的功能。并不是所有糖尿病中上调的RCS 均与所有细胞蛋白质发生反应并破坏所有细胞蛋白质的功能。例如，发现虽然在心肌细胞 中丙酮醛、乙二醛、丙二醛和4-羟基壬烯醛上调，但是仅丙酮醛和乙二醛在体内与2型利阿 诺定受体和肌（内）质网Ca2+ATP酶形成加合物。丙酮醛也是在糖尿病患者中观察到的痛 觉过敏的原因。
[0022] 丙酮醛是到目前为止鉴定的最有效的RCS。丙酮醛扰乱细胞内Ca2+稳态，并损害 线粒体功能，触发细胞功能失调和/或死亡。丙酮醛是由磷酸丙糖中间体的氧化而合成、经 由丙酮单氧酶/丙酮醇单氧酶（AMO)由丙酮/丙酮醇来合成、以及经由膜结合酶血管粘连 蛋白-I