的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种高效制备纽莫康定B0的方法。
【背景技术】
[0002] 纽莫康定B。（pneumocandinB。）是由产生的次级代谢产物， 在发酵时除了会产生纽莫康定B。以外还会产生结构类似物A。以及同 分异构体C。。作为抗真菌药物卡泊芬净的前体化合物，制备高纯度的纽莫康定B。对卡泊芬 净的精制纯化至关重要。
[0003] 中国发明专利200910133118. 0公开了制备纽莫康定B。的方法，主要步骤是：a) 离心纽莫康定B。发酵液，取菌丝体，用甲醇浸提纽莫康定B。山）将甲醇浸提液蒸干，再用正 丁醇浸提纽莫康定B。；c)将正丁醇浸提液蒸干，再用70~80%甲醇浸提纽莫康定B。，过酸 性氧化铝柱，收集流出液；d)将纽莫康定B。收集蒸干后，用60~70%甲醇溶解，上HP20吸附 树脂，用85~95%甲醇洗脱，收集洗脱液纽莫康定B0纯度在50~65%间；e)将纽莫康定B。收 集液蒸干，溶于反相树脂YPR-II，用85~95%甲醇洗脱，收集纽莫康定B。纯度大于90% ;f) 将纽莫康定B。收集液蒸干后，用甲醇溶解，滴加少量水使之过饱和结晶析出，制得纽莫康定 B。 ，纯度可达到96%。该方法没有对同分异构体C。进行检测和纯度控制，而一般发酵液中的 C。 杂质含量在10%左右，该方法得到的是B。和C。的混合物，在下一步的合成反应中将严重 影响卡泊芬净的质量。
[0004] 中国专利201410051009. 5公开了一种高效制备纽莫康定B。的方法，主要包括：a) 将含有纽莫康定B。的发酵液pH调至2. 0~4. 0,过滤，浸提纽莫康定B。的浸提液；b)浸提液 浓缩后加入硅藻土裹晶，再加入水搅拌，离心；c)离心固体用乙醇溶解，加入活性炭脱色过 滤；d)滤液浓缩，加入氯仿过硅胶柱，收集纽莫康定B。的过柱液；e)纽莫康定B。的过柱液 浓缩至干，在多相溶剂体系下结晶，得到纽莫康定B。。该方法虽对C。杂质进行了检测和纯 度控制，但它的回收率较低，而且采用薄层色谱监测，操作复杂，不利于实际生产应用。
[0005] 中国发明专利201410711185. 7公开了一种采用动态轴向压缩柱制备高纯度纽 莫康定B。的方法，包括以下步骤：a)将含有纽莫康定的发酵液做酸沉、离心、脱色预处理，得 纽莫康定粗品；b)采用动态轴向压缩柱装填硅胶填料；c)将步骤a)所得的纽莫康定粗品 浓缩干燥后，加入氯仿/甲醇混合物溶解，上样，氯仿/甲醇/水混合液洗脱，紫外检测峰值 最大时收集洗脱液，得目标组分，浓缩干燥即得纽莫康定B。。该方法虽采用了动态轴向压缩 柱来代替传统的硅胶柱，但过程中的固液分离仍采用传统离心和旋转蒸发，分离过程效率 低，能耗高，损失大。
[0006] 现有技术在制备过程中大多采用离心或蒸发的方式进行分离和浓缩，采用吸附树 脂或活性炭来除杂纯化，工艺效率低，回收率低，能耗高。且过程中多采用毒性较大物质，对 环境的控制难度大。因此降低过程能耗，提高工艺效率，提高回收率，以及更加环保的试剂 对纽莫康定B。的工业化生产有着很重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的技术目的在于从含发酵菌体中的发酵液体系中分离获得纽莫康定B。，为 了达到本发明的技术目的，本发明的技术方案为： 一种分离获取纽莫康定B0的方法，其中，分离的具体步骤为： a. 采用管式膜过滤含有纽莫康定B。的发酵液，得菌体和过滤液 b. 用乙醇对菌体进行浸提，固液分离获得浸提液，用管式膜浓缩浸提液获得浓缩液a; c. 用管式膜将过滤液浓缩脱水得浓缩液b; d. 混合浓缩液a和浓缩液b，控制乙醇质量浓度为5%~30% ; e. 调混合液的pH至3~6,得悬浊液；用管式膜过滤悬浊液，截留获得固体； f. 将固体用乙腈溶解，调节pH为5~8,在溶液中加入硅胶后，将乙腈蒸干，取固体装柱， 并用乙酸乙酯和甲醇的混合液对硅胶柱进行梯度洗脱至流出液中没有纽莫康定B0,收集洗 脱液； g. 对洗脱液进行蒸发浓缩后，结晶得到纽莫康定B。； 本发明所述的方法，所述的步骤b中每千克湿菌体中加入乙醇的体积为2~3L，浸提次 数为1~3次，浓缩液a的体积为浓缩前体积的2~10%。在本步骤中，乙醇加入的目的为提取 菌体中的产品。
[0008] 优选的，在膜分离后的菌体进行洗涤。
[0009] 本发明所述的方法，所述的步骤e中pH值为3~4。
[0010] 本发明所述的方法，所述步骤f?中pH为6. 5~8. 0 ;所述硅胶目数为100~200,样品 与溶解硅胶的质量比值为1~2 :1。
[0011] 本发明所述的方法，步骤f中洗脱液中乙酸乙酯：甲醇的质量配比为7~15 :1。
[0012] 本发明所述的方法，所述步骤a)中管式膜的膜孔径为0. 03~0. 5Wn，优选 0? 05~0. 2Mm;运行压力为 0?l~lMPa，优选 0? 2~0. 8MPa。
[0013] 本发明所述的方法，所述步骤b)中管式膜的截留分子量为100~1500,优选为 500~1000 ;运行压力为 1. 0~3.OMPa，优选 1. 5~2. 5MPa。
[0014] 本发明所述的方法，所述步骤c)中管式膜的截留分子量为300~3000,优选为 500~2000 ;运行压力为0. 5~1. 5MPa，优选0. 8~1. 5Mpa;浓缩体积为原体积的5%~30%。
[0015] 本发明所述的方法，所述步骤e)中管式膜的膜孔径为0. 01~0.lum，优选 0? 02~0. 5um，运行压力为 0? 2~1.OMPa，优选 0? 2~0. 8MPa。
[0016] 本发明所述的方法，所述步骤g中的结晶溶解温度为40~50°C，析晶温度为0~4°C。
[0017] 本发明的有益效果在于： a) 采用管式膜取代离心机，连续操作性好，分离效率高； b) 膜浓缩醇提液，可以有效去除小分子杂质。且乙醇的回收率高，过程的能耗低，缩减 了生产成本。
[0018] c)采用乙酸乙酯和甲醇混合液梯度过硅胶柱，得到了高纯度的过柱液，而且乙酸 乙酯和甲醇是后续结晶体系的有机相，方便了后面的结晶过程，节约了成本。
[0019] d)制备过程中采用的都是毒性小或无毒的溶剂，环境控制的难度较低。
[0020] e)将发酵菌体与发酵液分离后分开提取产品，由于菌体与发酵液的物性差异，使 得提取过程中更加有针对性与效率，提高产品的纯度与收率。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本 发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。
[0022] 实施例1 取纽莫康定B0的发酵液50L，在运行压力为0. 5MPa下，用膜孔径0. 2iim的管式膜过滤 发酵液。得菌体21kg，过滤液23L。
[0023] 向菌丝体中加入25L乙醇浸提，充分搅拌30分钟后过滤得乙醇浸提液26L。用25L 乙醇第二次对菌体进行浸提，过滤后共得浸提液52L。
[0024] 在运行压力为2. 5MPa下，用截留分子量600的管式膜浓缩浸提液得浓缩液a2L。 在运行压力为2.OMPa下，用截留分子量2000的管式膜浓缩过滤液得浓缩液b8L。
[0025] 混合浓缩液a和浓缩液b，调pH4. 0,搅拌几分钟后，有大量析出物，得悬浊液。自 由沉降几分钟后，经检测，发现液体中无纽莫康定B0检出。
[0026] 在运行压力为0. 4MPa下，用膜孔径0. 05Wii的管式膜过滤上述悬浊液。得粗品210 g°
[0027] 用1. 5L乙腈将固体完全溶解，调pH6. 5。向其中加入300g硅胶，搅拌30分钟。在 40°C，真空度-0. 05MPa的条件下蒸干，得到吸附了样品的干硅胶粉。
[0028] 采用湿法装柱，用乙酸乙酯逐渐将柱子（120mm*700mm)装实后加入样品。用 7~15 :1 (乙酸乙酯：甲醇)混合液梯度洗脱硅胶柱，经HPLC检测有纽莫康定B0检出，5倍柱 体积洗脱后，流出液中没有纽莫康定B0,得洗脱液20L。
[0029] 将上述洗脱液蒸发浓缩至2L，加入200ml水混合浓缩液。放置于4°C冰箱中结晶 2小时，析晶，离心，得固体潮晶；将潮晶放到冷冻干燥机中干燥，得成品58g。
[0030] 制得的成品经HPLC检测C0纯度为0. 2%，纽莫康定B0的正相纯度为99. 8%，反相 纯度为98. 6%。
[0031] HPLC高效液相检测方法为： ① 反相检测条件： 测定柱：C18柱，4. 6mmX250mmX5um，柱温：35°C;采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，B相 为0. 3%磷酸水溶液；流速为lmL/min;检测波长：210nm;进样量：10ML。
[0032] 梯度洗脱表为： ② 正相检测条件：
测定住：Si02柱，4. 6_X250_X5um;柱温35°C;流动相A为乙酸乙酯（84%)，流动相B为甲醇（9%)，流动相C为水（7%);流速为lmL/min;检测波长278nm;进样量20ML。运行时 间 30min。
[0033] 实施例2: 取纽莫康定BO的发酵液50L，在运行压力为0. 5MPa下，用膜孔径0. 3um的管式膜过滤 发酵液。得菌体20kg，过滤液24L。
[0034] 向菌丝体中加入30L乙醇浸提，充分搅拌30分钟后过滤得乙醇浸提液32L。用30L 乙醇第二次对菌体进行浸提，过滤后共得浸提液64L。
[0035] 在运行压力为2. 5MPa下，用截留分子量600的管式膜浓缩过滤液得浓缩液a2L。 在运行压力为2.OMPa下，用截留分子量3000的管式膜浓缩过滤液得浓缩液b10L。
[0036] 混合浓缩液a和浓缩液b，调pH3. 5,搅拌几分钟后，有大量析出物，得悬浊液。自 由沉降几分钟后，经检测，发现液体中无纽莫康定B0检出。