酰化胰岛素的色谱纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酰化胰岛素的反相色谱纯化方法，属于重组胰岛素或胰岛素类似 物的制备领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种常见的代谢内分泌疾病，严重危害人类健康。酰化胰岛素是一种中 性的、可溶的、长效胰岛素类似物，例如地特胰岛素，即赖氨酸B29N(e-十四酰）去（B30) 人胰岛素，是第一个采用化学修饰的方法，用能与血液中的白蛋白可逆结合的脂肪酸酰化 肽链上的氨基酸而产生。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆性 结合，使酰化胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能减 少低血糖的风险。
[0003] 在胰岛素的发展史中，制备型高效液相技术的引入为胰岛素质量的提升起到十 分关键的作用，使得从动物中提取的胰岛素和利用基因重组技术制备的人胰岛素的纯度 从90 %左右提升到98 %甚至更尚，包括脱氣广物在内的性质与膜岛素十分接近的相关物 质的含量也得到很好的控制，胰岛素的安全性进一步得到保障。目前主要的色谱纯化工 艺有两种：一是通过选用有机聚合物填料进行胰岛素或胰岛素类似物的纯化，如中国专利 CN103275210A中采用Source15RPC、Source30RPC有机聚合物填料，在洗脱液pH2-4环 境下可有效的对一种脂肪酸单酰化胰岛素进行纯化，纯化后样品纯度可达到98%，样品收 率为71. 9% ;二是通过选用高级硅胶载体填料进行胰岛素或胰岛素类似物的纯化，如中国 专利CN1171742A中采用C4填料在50mm制备柱上进行酰化后胰岛素的纯化，纯化后样品纯 度未知，样品收率为40. 2%。
[0004] 有机聚合物填料一般采用中低压设备，而高级硅胶载体一般采用高压层析设备。 比较来看，虽然采用有机聚合物填料进行纯化的设备维护成本较低，但是具有许多明显的 缺点：第一，有机聚合物填料的粒径（一般在30微米以上，大至几百微米）比普通高级 硅胶载体填料粒径（一般在5-20微米之间）大很多，由于介质自身的耐压性能差，装柱 过程承压能力有限，装填好的柱子内部介质不会致密均匀，测定的理论塔板数一般不会超 过20000,新装填的层析柱柱效不高，从而导致样品分离度较低，纯化后样品纯度较难达到 98%以上且收率较低，这将明显增加产品的生产成本；第二，有机聚合物填料粒径一般在 5-300ym之间，颗粒均一度较差，耐压性较低，在装填层析柱和纯化过程中都会造成填料的 破碎，从而导致层析柱内部产生塌陷造成柱效下降，分离度降低，进一步造成收率下降。
[0005] 相比来看，高级硅胶载体填料装填的柱子，柱效一般可以达到40000以上，且填料 能够耐受lOMPa压力，不易碎，长期纯化试验后柱效较稳定，不会降低；且在较高的耐受压 力下，纯化过程中的线性流速可以更高，可做到对胰岛素类似物的快速纯化，更好的避免在 色谱纯化过程中目的产物发生不利反应，如脱氨反应等，从而影响样品纯度和收率。
[0006] 因此，建立一种方法简捷，产品的纯度及收率高，具有较强的可放大性、适合作为 工业化纯化酰化胰岛素或其类似物的色谱纯化方法，将具有重要的价值和应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种酰化胰岛素的色谱纯化方法，该方法可一 步将粗样品的纯度由50-60%提高至99. 0%以上，且纯化后样品收率稳定在90%以上，具 有较强的可放大性、适合作为工业化纯化酰化胰岛素或其类似物的色谱纯化方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明首先公开了一种酰化胰岛素的色谱纯化方法，包括以下步骤：（1)以高级 硅胶载体作为层析填料，将色谱柱用平衡液进行平衡，将待纯化的酰化胰岛素粗品上样，用 平衡液平衡色谱柱；（2)用洗脱用流动相进行洗脱，收集主峰，得到目的产物酰化胰岛素纯 品；其中，洗脱用流动相包括A相和B相；所述洗脱用流动相A相的pH为6. 5-8. 0,优选的， 所述洗脱用流动相A相的pH为7. 0-8. 0,最优选为pH7. 0。
[0010] 其中，所述A相为磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷 缓冲液、硼酸_硼砂缓冲液中的任意一种或多种，优选为磷酸盐缓冲液。本发明通过调节磷 酸盐缓冲液中磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的比例，达到A相所述pH;或者通过加入盐酸或者 氢氧化钠调节A相的pH值。
[0011] 所述B相包括有机溶剂和水；其中所述有机溶剂为乙腈或碳原子数为C1-C4的醇 中的任意一种或多种，优选为乙腈或乙醇；更优选的，所述B相由乙腈和水按体积比9 :1组 成；或者，由乙醇和水按体积比9 :1组成。
[0012] 本发明色谱纯化方法，步骤⑴所述高级硅胶载体（即层析填料）的配基为C4-C18的烷烃，优选为C8烷烃；其中，所述配基是在高级硅胶载体的表面所键合的烷烃。本 发明所述高级硅胶载体填料的装填压力为7-10MPa。所述层析填料的平均粒度为5-30ym， 优选为5-10ym。填料粒度越小，柱效越高，样品纯化分离度越高。步骤（1)所述平衡液包 括A相和B相，与洗脱用流动相中的A相和B相相同；按照体积比计，步骤（1)所述平衡液 由75% -90%的A相和10% -25%的B相组成，优选为由80%的A相和20%的B相组成。
[0013] 按照体积比计，步骤⑵所述洗脱用流动相由50 % -60 %的A相和40 % -50 %的 B相组成，优选为由55%的A相和45%的B相组成。步骤（2)所述洗脱的方式为等度洗脱 方式（即在洗脱过程中A相与B相的比例不变）或者线性梯度洗脱方式的任意一种。
[0014] 本发明考察了层析填料的不同配基对酰化胰岛素分离效果的影响，结果表明C4、C8、C18三种配基都可以达到较好的纯化效果，纯化后样品纯度达97. 89% -99. 28%，纯化 收率为85. 5% -91. 5% ;其中C8配基对于酰化胰岛素的纯化效果优于另外两种填料配基， 且具有统计学意义上的显著性差异。
[0015] 本发明进一步考察A相不同的pH洗脱条件下对样品分离效果的影响，结果表明， 在A相偏碱性（pH7. 5)的洗脱条件下对目的蛋白的纯化效果明显好于偏酸性（pH3. 5)洗脱 条件，纯化后样品纯度更高，达99. 25%，且纯化收率也更高，达90. 9 %。因此，本发明认为 对于采用高级硅胶载体填料纯化酰化胰岛素，采用偏碱性的洗脱条件更容易得到纯度和收 率都更高的样品。同时，本发明围绕A相pH7. 5的洗脱条件对pH条件又进行优化，结果表 明当A相pH6. 5至8. 0时，目的蛋白纯化后的纯度和收率都较高，分别达98. 89% -99. 55% 和88. 1 % -93. 9%，尤其当A相pH为7. 0时，洗脱下来的目的蛋白纯度最高，且纯化收率也 最尚。
[0016] 本领域一般认为高级硅胶载体填料在酸性洗脱条件下可以达到最好的纯化效果。 中国专利CN1313866A公开了采用高级硅胶载体填料在酸性（pH3. 5)洗脱条件下可以达到 最好的纯化效果，纯化后样品纯度大于98. 5%，产率68% ;而采用有机聚合物为固定相，在 碱性（PH9.0)条件下洗脱，纯化后样品纯度大于98. 5%，产率64%-73%。采用色谱的方式 纯化酰化胰岛素粗品时，当纯度达到98%以上时，在不影响收率的前提下，即使将纯度提高 〇. 5个百分点也是十分困难的。与已公开的相关中国专利在主要工艺参数及纯化效果相比 较，本发明酰化胰岛素的色谱纯化方法，通过采用高级硅胶载体填料（配基为C4-C18的烷 烃的反相硅胶填料），在碱性（pH6. 5-8.0)洗脱液环境下，可一步将酰化后粗样的纯度由 50-60%提高至99. 0%以上且纯化后样品收率稳定在90%以上，纯化后样品纯度和收率都 远高于现有技术所获得的成果。另外，本发明粗样样品的上样量大，超过16克/升床层体 积，远大于已公开的专利或技术中提到的胰岛素类似物色谱纯化上样量；色谱纯化过程中 线性流速高达250cm/h，可做到对胰岛素类似物的快速纯化。
[0017] 本发明所述待纯化样品是由去B30的人胰岛素（即将人胰岛素B链上天然排列在 第30位的苏氨酸去掉）和选自以下任意一种的脂肪酸酯反应制得的酰化胰岛素溶液：棕榈 酸N-琥珀酰亚胺基酯、辛酸N-琥珀酰亚胺基酯或肉豆蔻酸N-琥珀酰亚胺基酯。反应后的 目的产物（即酰化胰岛素）为脂肪酸酯与去B30的人胰岛素的B29_Lys的e-氨基反应并 以酰胺键相连形成的产物，同时在反应溶液中还存在许多杂质，如非目的位点修饰的产物 和未完全反应的原料（脂肪酸酯与去B30的人胰岛素）等。人胰岛素是由51个氨基酸组 成的酸性小分子蛋白质，分子式为C257H3S3N65077S6,分子量5807. 69。而本发明所述人胰岛素 包括：有机合成的人胰岛素或通过基因工程制备的重组人胰岛素；其中，有机合成的人胰 岛素是根据人胰岛素的结