一种天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种及其筛选、发酵和鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品添加剂技术领域，尤其是涉及一种天然防腐剂ε -聚赖氨酸菌种及其筛选方法。本发明所述菌种于2014年12月14日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号M 2014646，CCTCC NO:Μ 2014646，中文命名为分隔北里抱 ΚΥ3，英文命名为 jfiiasaiaSjOara clausa KY3。
【背景技术】
[0002]食品腐败是指食品中的蛋白质受腐败细菌产生的蛋白质分解酶的作用而被分解，依次向低分子化合物降解，生成各种有毒物质和不愉快气味物质的过程。食品腐败不仅降低了食品的食用价值，并带来巨大的经济损失。目前，添加食品防腐剂是主要的防腐措施之一，食品防腐剂是能防止由微生物引起的腐败变质、延长食品保质期的添加剂。在食品添加剂市场上使用的防腐剂种类很多，其中很大一部分是人工合成防腐剂，如山梨酸钾、苯甲酸钠等，超剂量滥用对人体可能会有一定的毒副作用。因此，开发绿色、安全、高效的生物防腐剂尤其是微生物防腐剂成为增加市场竞争力，提高经济效益和人民生活质量的重要举措。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种天然防腐剂，筛选出新的ε -聚赖氨酸菌种，为进一步选育聚赖氨酸高产菌株提供了优良的新出发菌。此外，本发明提供了一种天然生物代谢产物一一 ε-聚赖氨酸，它是一种强力的天然抗菌防腐剂。本发明要解决的另一个问题是聚赖氨酸菌种的筛选方法。
[0004]本发明的目的是通过下述技术方案实现的:
一种天然防腐剂ε -聚赖氨酸菌种，其特征在于，中文命名为分隔北里孢ΚΥ3，英文命名为Kitasatospora clausa KY3 ;该菌种于2014年12月14日保藏于位于中国?武汉?武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号M 2014646，CCTCC NO:M 2014646。
[0005]本发明还提供该天然防腐剂ε -聚赖氨酸菌种的筛选方法，其步骤包括，
(1)选取土壤样品，自然风干7天，碾碎，60°C烘2小时；
(2)取Ig烘干后土壤样品，加入1mL质量分数为0.85%的盐水中，30°C振荡10分钟，然后静置30分钟，吸取上清液；
(3)将20μ L的上清液涂布于含有浓度为130mg/L的K2Cr2O7的初筛培养基上，28-30°C培养5天；
(4)挑选产生透明圈的单菌落，置于斜面培养基上28°C培养3天，通过滴加Dragendorff试剂进行检验，周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株，即为ε -聚赖氨酸菌株。
[0006]为了获得更好的技术效果，步骤(I)中所述土壤选自江西省樟树市郊水稻田或菜地； 步骤(3)中所述初筛培养基的组成为:甘油8-10g、琼脂15-18g、酵母膏0.2-0.4g、NaH2PO4 0.5-0.8g、MgSO4 ■ 7H20 0.3-0.5g、( NH4 ) 2S04 0.6_0.8g、120_150mL 痕量矿物溶液，定容至1L，用质量浓度0.1%的稀盐酸或氢氧化钠溶液将pH调节为6.5-7.5，并在IXlO5Pa 下 121°C 灭菌 30_50min ；
所述痕量矿物溶液组成为:NaCl lg、H3BO3 0.0lg、CaCl2- 2H 20 0.1g、NH4Mo7O24- 4H 200.0lg，定容至IL ；
步骤(4)中所述斜面培养基含有初筛培养基和占初筛培养基体积分数为0.002%的美.~~.0
[0007]本发明还提供该天然防腐剂ε -聚赖氨酸菌种的发酵方法，其步骤包括，
(1)在5L自动发酵罐中装入3.5 L混合液，混合液中含有800-1000 g/L葡萄糖和500-600 g/L (NH4)2SO4，按接种量8% (质量分数)取ε _聚赖氨酸菌种；
(2)在5L自动发酵罐中通风量1.0 vvm，温度30 °C，溶氧(DO)维持在20%，溶氧-转速联动；
(3)初始pH值为6.8，当pH自然下降到3.8时，自动流加10%的氨水维持pH 3.8，每隔3-6 h取样测量生物量、葡萄糖及ε-PL浓度，至碳源耗尽。
[0008]本发明还提供该天然防腐剂ε -聚赖氨酸菌种的鉴定方法，其步骤包括，
1)形态与培养特征:将ε-聚赖氨酸菌种置于在甘油-天门冬琼脂上，30°C培养48h，孢子丝呈波曲状，生成气丝为灰白色，生长致密，在电子显微镜下孢子长椭圆形至椭圆形，大小差别较大；
2)细胞壁化学组分分析:将聚赖氨酸菌种发酵纯化产物的水解液，聚赖氨酸标准品的水解液和赖氨酸标准品进行薄层层析，结果显示ε -聚赖氨酸菌种纯化产物及ε -聚赖氨酸的水解产物和赖氨酸标准品在薄板上仅形成一个斑点，且Rf值相等，因此ε -聚赖氨酸菌种发酵产物为赖氨酸的均聚物；采用Sanger法测定其酰胺键连接方式为ε结构，ε -聚赖氨酸菌种细胞全水解液中含有LLDAP，mesoDAP，糖成分有鼠里糖和葡萄糖；
3)ε -聚赖氨酸菌种16S rDNA全系列的相似性比较和系统发育分析:经PCR扩增、BLAST对比后，发现ε -聚赖氨酸菌种与分隔北里孢菌的16S rDNA序列相似性达到99%，认为是分隔北里孢菌(Kitasatospora clausa)。
[0009]作为优化，步骤(I)中所述甘油-天门冬培养基(g/L):甘油20，天冬素0.5，牛肉膏2，K2HP04 0.5，琼脂20，pH 6.8，115°C灭菌20min ;步骤(2)中，所述ε -聚赖氨酸菌种发酵纯化产物的水解液通过以下方法获得:刮取ε -聚赖氨酸菌种的孢子两环，接种到装在500mL三角瓶内的80 mL M3G培养基中，30°C，200 rpm培养24 h至生长对数期，提取水解液；
作为优化，所述M3G培养基为:葡萄糖50-80 g，酵母粉5-8 g，(NH4)2SO4 10-12 g，KH2PO4.2H20 1.4-1.6 g，MgSO4.7H20 0.5-0.8 g，K2HPO4.2H20 0.8-1.0 g，FeSO4.7H200.03-0.05 g，ZnSO4.7H20 0.03-0.05 g，加水定容至1L，用0.1%稀盐酸或氢氧化钠溶液将pH 调节为 6.8-7.2。
[0010]ε -聚赖氨酸是一种由25-35个L-赖氨酸残基构成的同聚物，它是一种广谱的抑菌剂，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌及酵母都具有不同程度的抑制作用。它安全性能高，热稳定性好，是一种天然的抗菌防腐剂，对人体不仅无害，还具有一定的营养价值，是今后开发的方向，是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂。
【具体实施方式】
[0011]下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0012]实施例1
一种天然防腐剂ε -聚赖氨酸菌种，其特征在于，中文命名为分隔北里孢ΚΥ3，英文命名为Kitasatospora clausa KY3 ;该菌种于2014年12月14日保藏于位于中国?武汉?武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号M 2014646，CCTCC NO:M 2014646。
[0013]实施例2
实施例1所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的筛选方法，其步骤包括，
(1)选取江西省樟树市市郊水稻田、菜地等地的土壤样品，自然风干7天，碾碎，60°C烘2小时；
(2)取Ig土样加入1mL质量分数为0.85%的NaCl溶液中，30°C振荡10分钟，然后静置30分钟，吸取上清液；
(3)将20μ L上清液涂布于含有130mg/L的K2Cr2O7初筛培养基上，28-30°C培养5天，筛选得到164株产碱菌株；
(4)挑选产生透明圈的单菌落，置于斜面培养基上28°C培养3天，通过滴加Dragendorff试剂进行检验，挑选出周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株，即实施例1所述ε -聚赖氨酸菌株，共得到59株。
[0014]其中，步骤(3)所述初筛培养基的组成为:甘油10g、琼脂18g、酵母膏0.2g、NaH2PO40.5g、MgSO4 ■ 7H20 0.3g、( NH4 )2S04 0.66g、120mL 痕量矿物溶液，定容至 1L，ρΗ7.0，并在 I X 15 Pal21°C 下灭菌 40min ;
所述痕量矿物溶液组成为:NaCl lg、H3BO3 0.0lg, CaCl2- 2H 20 0.1g、NH4Mo7O24- 4H