蜡样芽孢杆菌d13及其挥发性物质在防治水稻细菌病害中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及蜡样芽孢杆菌D13及其挥发性物质在防治水稻细菌 病害中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻黄单胞菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)是水稻白叶枯病的病原菌， 生长于木质部，沿叶脉引起黄白色的病斑。水稻白叶枯是亚洲国家水稻的主要病害，严重时 造成50-60%的减产。对水稻黄单胞菌的研究较为透彻，已报道的致病因子包括过敏反应、 II和III泌出系统分泌的产物、胞外多糖（EPS)、移动性、扩散性信号因素（DSF)和胞外酶 等。
[0003] 很久以前人们就认识到细菌能够产生特殊的气味，并开发为乳酪、酸奶和红酒的 芳香成分。近期的研究表明细菌可以通过产生挥发性物质与植物、真菌、线虫及其它细菌 进行互作。2003年，Ryu等首次发现细菌产生的挥发性有机化合物（volatileorganic compounds,VOCs)能够影响植物生长。在过去十年里，2, 3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、十六 烷基二甲基胺、2-戊基咲喃已被证实对植物生长有促进作用。BacillussubtilisGB03 产生的2, 3-丁二醇通过酸化根际、提高铁的吸收、调控植物体内生长素的合成转运及其 抑制ABA合成响应基因的表达等机制来促进植物的生长。此外，根际促生细菌（plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)产生的VOCs还能够引起植物对干燥、盐、营养缺 乏等非生物胁迫的抗逆性。例如细菌VOCs可以提高植物对铁的吸收和调节植物体内钠的 平衡。2004年，Ryu首次报导根际促生细菌分泌的挥发性物质能够诱导拟南芥系统抗性的 产生。13.&11171〇119116€&(^6118預937&和13.811131:;[118 61303产生的2,3-丁二醇能够明显提 高拟南芥对胡萝卜软腐果胶杆菌的抗性。除此之外，PaenibacilluspolymyxaE681分泌 的十三烧也能诱导植物产生系统抗性（Inducedsystemicresistance,ISR)。
[0004] 早于1966年细菌产生的挥发性物质就被报道能够影响真菌的生长和发 育。研究表明灰色链霉菌（Streptomycesgriseus)产生的挥发性物质能够明显减少 Gleosporiumaridum的抱子形成，促进白腐小核菌（Sclerotiumcepivorum)和立枯丝核 菌（Rhizoctoniasolani)菌核的形成。目前已报道具有抑真菌活性的挥发性物质包括二 甲基二硫醚、i^一烯、苯甲醛、环己醇、癸醛、2-乙基-1-己醇、苯并噻唑、二甲基三硫醚以及 一些中长链的烷类、烯类、醛类和醇类等。
[0005] 近期，有研究表明枯草芽孢杆菌产生的挥发性物质能够降低大肠杆菌的移动性并 提高其对抗生素的适应性，然而关于PGPR挥发性物质对病原细菌的研究则相对较少。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种对水稻白叶枯病菌具有抑制 作用的蜡样芽孢杆菌D13。
[0007] 本发明的另一目的是同工蜡样芽孢杆菌D13在防治水稻白叶枯病菌中的应用。
[0008] 本发明的又一目的是提供蜡样芽孢杆菌D13的挥发性物质在防治水稻白叶枯病 菌中的应用。
[0009] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0010] -种对水稻白叶枯病菌具有抑制作用的蜡样芽孢杆菌D13,保藏于中国普通微生 物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo. 10243,保藏日期为2014年12月25日。
[0011] 本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13在制备防治水稻细菌病害的生物农药中的应用， 优选在制备防治水稻白叶枯病的生物农药中的应用。
[0012] 本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13产生的挥发性物质在防治水稻细菌病害中的应 用，优选在防治水稻白叶枯病中的应用。
[0013] 本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13产生的挥发性物质在制备防治水稻细菌病害的 生物农药中的应用，优选在制备防治水稻白叶枯病的生物农药中的应用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本发明筛选出挥发性物质对黄单胞菌有抑制效果的菌株蜡样芽孢杆菌D13。D13 产生的挥发性物质对Xoo具有抑制效果，低浓度时，D13产生的挥发性物质可以抑制水稻黄 单胞菌的swarming和致病能力，而高浓度时则会增强细胞膜通透性和胞内物质的裂解，从 而导致细胞死亡。本发明利用固相微萃取结合GC-MS对D13产生的挥发性物质进行鉴定， 产生的挥发性物质主要包括酸类、醇类、苯类、酮类及其含硫含氮化合物。其中，癸醇（DA) 和3, 5, 5-三甲基己醇（TMH)能有效地抑制Xoo的生长，此外3, 5, 5-三甲基己醇对水稻细 菌性条斑病菌、番茄细菌性斑点病菌和番茄青枯病菌也有同样的抑制效果。这些结果表明 D13产生的挥发性物质具有广谱毒性，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0016]图1芽孢杆菌挥发性化合物对水稻白叶枯的抑菌效果
[0017] 图2基于gyrB序列构建的BacilluscereusD13系统发育树
[0018] 图3芽孢杆菌挥发性物质对Xooswarming能力影响
[0019] 图4芽孢杆菌挥发性物质对Xoo菌落直径的影响
[0020] 图5芽孢杆菌挥发性物质对Xoo活力的影响
[0021] 图6芽孢杆菌挥发性物质对Xoo致病相关基因表达水平的影响
[0022] 图7芽孢杆菌挥发性物质对Xoo致病力影响
[0023] 图8扫描电镜下芽孢杆菌挥发性物质处理后的Xoo菌体形态
[0024] A:control；B:D13
[0025] 图9透射电镜下芽孢杆菌挥发性物质处理后的Xoo菌体形态
[0026] A:control;B:D13〇
[0027] 图10芽孢杆菌抑Xoo挥发性物质筛选
[0028] 其中，LA(十二烷酸），TA(十三烷酸），MA(十四酸），PA(十六酸），MCP(3-甲 基-1，2-环戊二醇），TMH(3, 5, 5-三甲基己醇），DA(癸醇）和PC0 (2-二十五烷酮）.
[0029] 图11不同浓度的DA和TMH对Xoo生长的影响
[0030]图12DA和TMH对Xoc、Pst和Rst生长的影响
[0031] 其中水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)，番前细菌 性斑点病菌（Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,Pst)和番前青枯病菌（Ralstonia solanacearumpv.tomato,Rst).
[0032] 生物材料保藏信息
[0033] D13,分类命名为蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo. 10243。
【具体实施方式】
[0034]实施例1挥发性物质具有抑细菌活性的芽孢杆菌菌株筛选
[0035] 采用分隔培养皿的方法筛选挥发性物质具有抑菌活性的芽孢杆菌菌株。芽孢杆菌 菌株包括从马来西亚分离的菌株及实验室保存的一些芽孢杆菌。分隔培养皿的一边倒入LB 固体培养基，并加入30y1 10scfumL1的芽孢杆菌菌液，而在另一边倒入NA固体培养基和 10yl10scfumL1的Xoo菌液，以只有Xoo菌液不含芽孢杆菌菌液的处理为对照。28°C共 培养6d后测量Xoo菌落直径。我们从50株马来西亚分离的野生菌及实验室保存的模式菌 株中筛选出抑菌效果较好的菌株D13 (图1)，其产生的挥发性物质对Xoo具有明显的抑制效 果，且抑制率为37. 5%。其中D13为马来西亚分离的野生菌。
[0036] 对D13进行16SrRNA和gyrB扩增和测序，并将测序所得序列与NCBI数据库进行 blast比对，通过MEGA4. 0软件对D13和芽孢杆菌模式菌株进行系统发育分析，确定D13菌 株属于蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus)(图2);将D13送交