一种苹果酸—乳酸细菌及其应用
【专利说明】一种苹果酸一乳酸细菌及其应用
[0001] -、技术领域： 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种苹果酸一乳酸细菌及其应用。
[0002] 二、【背景技术】： 苹果酸一乳酸发酵（MLF)是干红葡萄酒生产必不可少的工序之一，目前，干红葡萄酒生 产中进行苹果酸一乳酸发酵通常有两种方法，一是自然触发，二是人工接种乳酸菌，但是迄 今国内还不能生产活性乳酸菌于粉，此类发酵剂全部依赖进口。究其原因在于葡萄酒生产 要求特殊的环境，大多数能够进行苹果酸一乳酸发酵的细菌很难在其中繁殖代谢。筛选出 适合中国葡萄酒生产的苹果酸一乳酸细菌尤为迫切。
[0003] 三、
【发明内容】
： 本发明为了解决上述【背景技术】中的不足之处，提供一种苹果酸一乳酸细菌及其应用， 其筛选出对不良环境抗性强、苹果酸-乳酸酶活力高、酿酒特性好的优良苹果酸一乳酸细 菌。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种苹果酸一乳酸细菌，其特征在 于：所述的苹果酸一乳酸细菌为酒酒球菌SD-lb，该菌株已于2014年4月2日保藏于中 国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCCN0. 8988，。
[0005]所述的酒酒球菌SD-lb的培养方法为： 1) 在固体分离培养基中，在28-30°C和厌氧充氮气条件下培养5-8天，得分离菌株； 2) 对步骤1)分离获得的菌株在液体培养基中进行菌种扩大，液体培养25-28°C，静置， 在培养菌到对数期末时进行离心收集菌体，离心转速为lOOOrpm; 所述的固体分离培养基为改良ATB培养基或改良MRS培养基。
[0006] 所述的改良ATB培养基：ATB培养基+50mg/L放线菌酮+50mg/L万占霉素。
[0007] 所述的改良MRS培养基：MRS培养基+10%番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万 古霉素。
[0008] 所述的ATB培养基的配方为：ATB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄 糖l〇g，硫酸镁〇? 2g，硫酸锰0? 05g，盐酸半胱氨酸0? 5g，1MHCL或NaOH调pH至4. 8。
[0009] 所述的MRS培养基的配方为：MRS培养基+10%番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/ L万古霉素。
[0010] 酒酒球菌SD-lb的分离方法为：在上述固体分离培养基即ATB培养基+ 50mg/L放 线菌酮+50mg/L万古霉素或MRS培养基+10%番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉 素上，采用涂布分离法对苹果酸-乳酸细菌进行分离，取样量为0.lml，培养温度为28°C， 在厌氧箱中充N2培养5-7天，充N2的量应大于厌氧箱内剩余体积的95%。
[0011] -种酒酒球菌SD-lb在制备葡萄酒中的应用。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明酒酒球菌SD-lb对葡萄酒环 境适应性良好，可用于葡萄酒行业以及相关的食品行业。
[0013] 四、【附图说明】： 图1为本发明微生物在干红葡萄酒生产中的应用步骤图。
[0014] 五、【具体实施方式】： 一种苹果酸一乳酸细菌，其特征在于：所述的苹果酸一乳酸细菌为酒酒球菌SD-lb，该 菌株已于2014年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCCN0. 8988 〇
[0015] 所述的酒酒球菌SD-lb的培养方法为： 1) 在固体分离培养基中，在28-30°C和厌氧充氮气条件下培养5-8天，得分离菌株； 2) 对步骤1)分离获得的菌株在液体培养基中进行菌种扩大，液体培养25-28°C，静置， 在培养菌到对数期末时进行离心收集菌体，离心转速为lOOOrpm; 所述的固体分离培养基为改良ATB培养基或改良MRS培养基。
[0016] 所述的改良ATB培养基：ATB培养基+50mg/L放线菌酮+50mg/L万占霉素。
[0017] 所述的改良MRS培养基：MRS培养基+10%番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万 古霉素。
[0018] 所述的ATB培养基的配方为：ATB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄 糖l〇g，硫酸镁〇? 2g，硫酸锰0? 05g，盐酸半胱氨酸0? 5g，1MHCL或NaOH调pH至4. 8。
[0019] 所述的MRS培养基的配方为：MRS培养基+10%番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/ L万古霉素。
[0020] 酒酒球菌SD-lb的分离方法为：在上述分离培养基即ATB培养基+ 50mg/L放线 菌酮+50mg/L万古霉素或MRS培养基+10%番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素 上，采用涂布分离法对苹果酸-乳酸细菌进行分离，取样量为0.lml，培养温度为28°C，在 厌氧箱中充N2培养5-7天，充N2的量应大于厌氧箱内剩余体积的95%。
[0021] -种酒酒球菌SD-lb在制备葡萄酒中的应用。
[0022] 将苹果酸-乳酸细菌(酒酒球菌SD-lb)进行pH、S02、酒精的抗性实验：具体做法 是，首先进行pH、S02、酒精单因子实验，然后进行复合实验，筛选出对逆境抗性强的苹果酸 -乳酸细菌(酒酒球菌SD-lb)。本发明所述的各种抗性实验方法是本领域内技术人员公知 的方法。
[0023] 苹果酸降解实验：将筛选出的菌株按107cfu/ml的接种量接入添加有3g/L的L-苹果酸ATB培养基中（pH4. 8)，每隔24h进行纸层析监测，观察苹果酸斑点的变化，以苹果酸 斑点消失时为苹果酸分解完毕。
[0024] 苹果酸-乳酸酶活力测定，表1为不同菌株苹果酸一乳酸酶活比较：苹果酸-乳酸酶活力的定义为：20°C条件下，在10ml的培养基中，苹果酸-乳酸细菌(酒酒球菌 SD-lb)24h降解苹果酸的毫克数与每毫升中活细胞数的对数值（logcfu/ml)的比值。试验 证明，SD-lb的苹果酸-乳酸酶活力优于对照菌株31DH。
[0025] 酿酒适应性实验（参见表2-表13):通过对苹果酸-乳酸发酵速率、苹果酸降解 率、挥发酸生成量、葡萄酒中有机酸、丹宁、总酚以及颜色发生的变化、酒体柔和指数发生的 改变以及氨基酸代谢对葡萄酒质量的影响等方面的综合测定，结合品尝分析，确定酒类酒 球菌（Oenococcusoeni)SD_lb为酿酒特性优良的菌株，该菌株已于2014年4月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，保藏号为：CGMCCN0. 8988,分类命名为：酒类酒球菌。
[0026] 表1不同菌株苹果酸-乳酸酶活比较 TableIComparisonofMLAwithdifferentstrains
表4各菌株MLF酒样挥发酸、总酸、pH比较 Table4Comparisonofvolatileacids,totalacidsandpHvaluesinwines afterMLFbydifferentstrains
表5不同菌株MLF酒样中苹果酸、乳