脐带血单个核细胞来源的dc-cik细胞制取方法及制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种免疫细胞制取和共培养方法，尤其涉及一种DC细胞和CIK细胞制 取和共培养方法，DC细胞和CIK细胞均诱导和分化自脐带血分离的单个核细胞，以及在治 疗肿瘤的免疫细胞制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 激活T细胞有赖于2个活化信号（肽-MHC-TCR复合体、共刺激分子⑶80/86与 ⑶4+T淋巴细胞表达的⑶28分子结合）的共同作用，刺激特异性细胞毒性T细胞（cytotoxic Tcell，Tc)和辅助淋巴细胞（Thelpercell，Th)增殖，激发机体产生肿瘤免疫或是增强免 疫应答能力。树突状细胞（Dendriticcell，DC)是迄今发现的功能最强的专职抗原提呈细 胞（antigenpresentingcell，APC)，成熟的DC可以通过II型组织相容性抗原（MHC-II) 等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。
[0003] 细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillers，CIK)是一类抗肿瘤抗病 毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。DC和同源CIK细胞共培养后即可获得DC-CIK细 胞。DC是机体内功能最强的抗原递呈细胞，其摄取、加工、处理抗原，高表达MHC-I、MHC-II 类分子、共刺激分子及粘附分子，促进T细胞信号传导分子的相互作用以及信号通路的激 活，活化的APC和T细胞可分泌IL-1，IL-2,IFN-y等，促进T细胞效应功能的发挥。因此， 如将具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC与具有高效抗瘤活性的CIK细胞联合起来治疗恶性 肿瘤，无疑会起到协同抗肿瘤作用。
[0004] 现有技术中的DC制备方法多采用含有GM-CSF和IL-4的培养基连续培养5天，第 6天加入TNF-a再继续培养2~3天。这种方法制备的DC细胞存在周期长、得率低和抗原 递呈能力差等缺点。CIK制备方法多采用病人的外周血单个核细胞，用此种细胞制备出的 CIK细胞多会存在繁殖能力差、细胞活性低、CD3+和CD56 +细胞所占比例较低等问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种DC细胞制取方法，将分离自脐带血的单个核细 胞分别进行分化成DC细胞，缩短DC细胞的培养时间。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种DC-CIK共培养制取方法，将分离自脐带血的 单个核细胞分别进行分化成DC细胞和CIK细胞后，再进行共培养。
[0007] 本发明的再一个目的在于提供一种DC-CIK共培养制取方法，采用多种因子对分 离自脐带血的单个核细胞进行分化制取DC细胞，缩短制取成熟DC细胞的时间，利于DC-CIK 共培养的制取。
[0008] 本发明提供的一种DC细胞制取方法，将分离自脐带血的单个核细胞分别进行分 化成成熟的DC细胞（mDC)。mDC具有的HLA-DR、⑶80、⑶83和⑶86表型占90%以上。
[0009] 成熟的DC细胞先采用巨细胞集落刺激因子（GM-CSF)、白介素4 (IL-4)和FMS样酪 氨酸激酶3配体（Flt3L)等因子分化获得未成熟的DC细胞（iDC)，然后再使用肿瘤坏死因 子a(TNF-a)、白介素1MIL-10)、白介素6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)作用于iDC获 得成熟的DC细胞。
[0010] 本发明提供的另一种DC细胞制取方法，先采用GM-CSF、IL-4和Flt3L分化分离自 脐带血的单个核细胞24小时~48小时获得iDC，然后使用TNF-a、IL-1 0、IL-6和PGE224 小时~48小时使iDC成为mDC。
[0011] 本发明提供的DC细胞制取方法，GM-CSF用量为20ng/ml~30ng/ml，如：但不仅 限于 20ng/ml、2lng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、 29ng/ml和 30ng/ml。
[0012] 本发明提供的DC细胞制取方法，IL-4用量为lOng/ml~20ng/ml，如：但不仅限于 10ng/ml、llng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ ml和 20ng/ml。
[0013] 本发明提供的DC细胞制取方法，Flt3L用量为45ng/ml~55ng/ml，如：但不仅 限于 45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、5lng/ml、52ng/ml、53ng/ml、 54ng/ml和 55ng/ml〇
[0014] 本发明提供的DC细胞制取方法，TNF-a用量为95ng/ml~105ng/ml，如：但不仅 限于 95ng/ml、96ng/ml、97ng/ml、98ng/ml、99ng/ml、100ng/ml、101ng/ml、102ng/ml、103ng/ ml、104ng/ml和 105ng/ml〇
[0015] 本发明提供的DC细胞制取方法，IL-1 0用量为5ng/ml~15ng/ml，如：但不仅限 于 5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、llng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml 和 15ng/ml〇
[0016] 本发明提供的DC细胞制取方法，IL-6用量为5ng/ml~15ng/ml，如：但不仅限于 5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、llng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml和 15ng/ml〇
[0017] 本发明提供的DC细胞制取方法，PGE2用量为0.3yg/ml~3yg/ml，如：但不仅限 于 0? 3yg/ml、0. 4yg/ml、0. 5yg/ml、0. 6yg/ml、0. 7yg/ml、0. 8yg/ml、0. 9yg/ml、1yg/ ml、2yg/ml和 3yg/ml〇
[0018] 本发明提供的另一种成熟的DC细胞可按如下方法获得，其包括：
[0019] 将4父106个/!111~5\106个/1111取自脐带血的单个核细胞置于37°(：，5%〇) 2培 养箱中孵育2小时后吸出悬浮细胞，清洗，于培养基中加入因子GM-CSF至25ng/ml，加入 IL-4至16ng/ml和加入Flt3L至50ng/ml分化24小时~48小时，期间保持GM-CSF、IL-4 和Flt3L终浓度稳定，获得iDC细胞；
[0020] 再使用 100ng/mlTNF-a、l〇ng/mlIL-1 0、10ng/mlIL-6 和 1yg/mlPGE2 作用 于iDC细胞24小时~48小时获得mDC细胞。
[0021] 采用本发明提供的DC细胞制取方法制取的DC细胞可与CIK细胞进行共培养，制 得DC-CIK共培养细胞制剂，作为药物用于肿瘤的免疫治疗。
[0022] 本发明提供的一种DC-CIK细胞制取方法，将分离自脐带血的单个核细胞分别进 行分化成DC细胞和CIK细胞后，再进行共培养，获得的DC-CIK共培养细胞具有CD3+和 ⑶56+免疫表型。
[0023] 本发明提供的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离，经红细胞裂解液 裂解后，用生理盐水清洗，低速离心后获得。
[0024] 本发明提供的DC-CIK细胞制取方法，DC细胞和CIK细胞按1 : 10~100进行共 培养，培养时间为7天~10天，IL-2浓度（95ng/ml~105ng/ml)保持稳定。
[0025] 本发明提供的一种CIK细胞可按如下方法获得，其包括：
[0026] 将4父106个/!111~5\106个/1111取自脐带血的单个核细胞置于37°(：，5%〇) 2培 养箱中孵育2小时后获得悬浮细胞，培养基稀释至细胞浓度1X106个/ml~3X10 6个/ml， 加细胞因子IFN-y至20~30ng/ml，置于37°C，5 % 0)2培养箱中，于次日加入Anti-⑶3mAb 至 95 ~105ng/ml，加入IL-2 至 95 ~105ng/ml，加入IL-1a至 3ng/ml~8ng/ml，并于 37°C，5%C02培养箱中继续培养4天~6天，期间IL-2浓度保持稳定。
[0027] 本发明所使用的培养基为以无血清淋巴细胞培养液为基础培养基，根据细胞 (如：DC细胞和CIK细胞）的培养要求还加入0.5v/v~lv/v%脐带血血衆。无血清淋 巴细胞培养液可通过商品化的培养液，如：但不仅限于X-VIV0?10(美国Lonza公司）和 X-VIV0?15(美国Lonza公司）等。
[0028] 本发明技术方案实现的有益效果