一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体而言，特指一种基于家蚕-杆状病毒表达系统、应用家蚕作为生物反应器来廉价、高效地制备具催化活性的人髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, ΜΡ0)的方法。
【背景技术】
[0002]人MPO是一种存在于正常人多形核中性白细胞(Polymorphonuclearneutrophils, PMN)嗜苯胺蓝颗粒(Azurophilic granules)中被糖基化的血红素包含形可溶酶，它通过催化形成强氧化物和次氯酸在自身免疫有氧杀灭微生物系统中扮演着重要角色。
[0003]针对自身免疫系统性血管炎和炎症性等疾病，利用抗中性粒细胞胞浆抗体(P-ANCA)进行诊断已成为既定工具。临床上常见的自身抗原是人MPO及蛋白酶3 (PR3)，通过抗原特异性诊断设备检测与这些抗原相对应的来自于中性粒细胞嗜天青颗粒的自身抗体，能够很容易的诊断出与抗中性粒细胞胞浆抗体相关的疾病。作为P-ANCA免疫荧光图谱的主要标靶，人MPO自身抗体指出了某些疾病的程度，如:特发性新月体性肾小球肾炎，Churg-Strauss综合征以及经典型结节性多动脉炎等相关疾病。
[0004]人MPO的基因编码全长为11千碱基(kilobase, kb)，最初的翻译产物是一个80千道尔顿(kilodalton，kDa)的蛋白，该蛋白N-端由41个氨基酸组成的信号肽段被酶解切除后，继而糖基化加入富含甘露糖的侧链后重新生成一个约90 kDa酶性不活跃的apoproMPO，当结合一个血红素基团后，apoproMPO变成了酶性活跃的前体蛋白ΜΡ0。N-端125个氨基酸前区通过酶解产生了一个约75 kDa的蛋白，经过第二次酶解生成由约57 kDa重链和约12 kDa轻链组成的重轻原体人ΜΡ0，最终包装成的一个成熟的人ΜΡ0，其分子量大约为150 kDa，由一对重链和一对轻链组成，两个重链沿着长轴由一个二硫键相连，富含甘露糖的糖基和两个铁素基团通过共价键与重链相连。
[0005]早期的研究表明，用人MPO的cDNA转染BHK细胞，观察到一个被糖基化了的85 kDa的precursor ΜΡ0，它从内质网被缓慢释放，但没有进行进一步的蛋白水解过程(Cully, J., et al, 1989, Exp.Cell Res., 180: 440-450)。Moguilevsky 等也观察到了一个从CHO细胞释放的具有酶活性的84 kDa的precursor ΜΡ0,尽管这个84 kDa的MPO与从 HL-60 细胞释放的 89 kDa 的 MPO 非常相似(Hur，S.-J., et al, 1989，J.B1l.Chem., 264: 8542-8548)，但也没有发现其具有蛋白水解过程(Moguilevsky，N., et al,1991，Eur.J.B1chem., 197: 605-614)。应用杆状病毒表达系统在Sf_9昆虫细胞中表达重组人MPO的实验表明，有两种形式的MPO被观察到，一种是84 kDa的释放形MPO (释放到培养基上清中)，另一种是在细胞内表达的74 kDa的ΜΡ0，这两种形式的MPO均显示被糖基化修饰，而只有胞内表达的74 kDa的MPO进行了翻译后的蛋白水解过程(Taylor，K.L.et al, 1992, B1chem.B1phys.Res.Commun., 187: 1572-1578)，但这两种形式的MPO均不具过氧化酶的活性。也有研究表明，在感染了含人MPO重组病毒的r.细胞培养基中添加血红素前体，其表达的释放形MPO具有相应的酶催化活性(Shin，K.et al,2000, B1chem.B1phys.Res.Commun., 271: 831-836)。
[0006]临床上用于自身免疫系统相关疾病体外诊断的MPO以人天然蛋白为最佳，但天然蛋白的资源有限，来源各异，导致纯化的天然抗原纯度低、批次之间不一致，且成本昂贵，以德国Diarect公司产品为例，每毫克天然(非重组)人MPO高达一万元人民币以上(http://www.eb1trade.com/custom/b1sun/ 100224/DIARECT.htm)。由于表达和蛋白折叠技术的瓶颈限制，利用体外表达系统所获得的重组人MPO成本高昂，如以色列ProSpec-Tany公司从大肠杆菌表达系统中制备的重组人MPO每毫克更高达八万元人民币以上(http://www.amyjet.com/products/ENZ-334.shtml)。严重制约了自身免疫系统相关疾病体外诊断技术的发展。
[0007]家蚕-杆状病毒表达系统凭借其高表达水平及强大的翻译后修饰功能而被普遍应用于大规模表达外源蛋白，通过家蚕-杆状病毒系统表达的人重组蛋白具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性与人的天然蛋白相似，且家蚕饲养简单方便，成本低，目前已经成为世界上最具商业开发价值的真核表达系统之一。
【发明内容】
[0008]针对制约在体外表达系统中制备重组人MPO的技术瓶颈，本发明首次提出一种高效、廉价、大规模制备重组人MPO的方法。本发明提出一种基于家蚕-杆状病毒表达系统，利用家蚕作为生物反应器，大规模、低成本、高效率地制备重组人MPO的方法。
[0009]本发明所采用的技术方案是:将完整的人MPO的cDNA (在C-端设计带有6个组氨酸)克隆到自身含6个组氨酸的供体质粒(pFastBacHTb)上，获得含人MPO基因的重组供体质粒；在大肠杆菌(菌株为BmDHlOBac)中和家蚕杆状病毒基因组杆粒(Bacmid)于转座子(Tn7)上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有目的基因的克隆，随后在家蚕细胞中(细胞株为BmN)制备含人MPO基因的重组病毒；感染宿主昆虫家蚕，同时给家蚕添加一定量的血红素前体；收集含表达了人MPO的家蚕幼虫的体液，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，4°C下进行高速离心，收集的上清应用镍-柱亲和层析结合离子交换层析的方法进行分离纯化，最终获得目的产物。
[0010]本技术方案所述的人MPO的cDNA来源于已公开的DNA序列(GenBank:BC130476.1);所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒(BmNPV);所述的宿主昆虫为家蚕(Bombyxmori)，品种为“306”;所述的宿主昆虫感染时间是五龄期幼虫；所述的感染方法是经昆虫皮下注射接种感染；所述的血红素前体的添加是经口喂食；所述的杆状病毒供体质粒是是商品化的质粒(型号为pFastBacHTb)。
[0011]本技术方案所述的分离纯化具体操作是:收集的经超声波裂解、高速离心后含表达了人MPO的上清，经过镍-亲和层析柱和离子交换层析柱分离纯化出高纯度的目的产物。所述的镍-亲和层析柱为带组氨酸标签蛋白纯化试剂盒，离子交换层析柱是指FPLC MonoS。
[0012]本发明的突出优点表现为:
表达量高:通过制备含人MPO家蚕重组杆状病毒感染五龄起蚕第二天的家蚕幼虫，在感染4-5天后收集高表达了人MPO的蚕血淋巴，经分离纯化后，每条蚕可制备高达1.7微克左右目的蛋白。
[0013]成本低:家蚕是目前唯一可以大规模商业化无菌饲养的昆虫物种，由于避免了苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)-昆虫细胞表达系统中昆虫细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清，使得用家蚕作为生物反应器制备人MPO的成本低。
[0014]
【附图说明】
[0015]图1为重组供体质粒的构建；
其中 A:聚合酶链式反应(Polymerase Chain React1n, PCR)产物(?2277 bp)。B:供体质粒 pFastBacHTb (Lane 1-2)和 PCR 产物(Lane 3-4) ^Xho I 和III 双酶切。C:连接反应前酶切产物胶回收效率的鉴定，Lane 1:供体质粒pFastBacHTb，Lane 2: PCR产物。D:挑选的克隆双酶切鉴定，Lane 1:空供体质粒作为对照，Lane 2_4:连接产物涂平板过夜后所挑选克隆经双酶切反应后的琼脂糖胶。图中酶切后的供体质粒和MPO片段分别用箭头表示，Lane M表示标准DNA标记(marker)，左边的数字表示标准DNA标记的位置，以碱基对bp (base pair)表示。
[0016]图2为发生同源重组家蚕Bacmid DNA的PCR鉴定；
其中以MPO中间引物C1669TGAATCGTCAGAACCAAATTG169。作为正引物和特异性反向引物(pUC/Ml3: 5’ -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)对挑选的白斑 Bacmid DNA 进行的 PCR 鉴定，图中M表示DNA marker，以左边的数字表示(bp)，“I”表示以未发生转座的蓝斑Bacmid DNA作为对照，“2”和“3”表示发生