L, Nauwynck HJ.2010b.The M/GP(5)glycoprotein complex of porcine reproductive and respiratory syndrome virus binds the sialoadhesin receptor in a sialic acid-dependent manner. PLoS Pathog 6 (1):e100 0730.
[0164] van den Hoff MJ, Moorman AF, Lamers WH. 1992. Electroporation in'intracellular'buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res20(11):2902.
[0165] Van Gorp H,Delputte PL, Nauwynck HJ. 2010a. Scavenger receptor CD163, a Jack-〇f-al1-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol 47(7-8) : 1650-1660.
[0166] Van Gorp H, Van Breedam ff,Delputte PL, Nauwynck HJ. 2008. Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. J Gen Virol 89 (Ptl2):2943-2953.
[0167] Van Gorp H,Van Breedam ff,Van Doorsselaere J,Delputte PL, Nauwynck HJ. 2010b.Identification of the CD 163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 84(6) :3101-3105.
[0168] Vanderhei jden N, Delputte PL,Favoreel Hff, Vandekerckhove J, Van Damme J, van ffoensel PA,Nauwynck HJ. 2003. Involvement of sialoadhesin in entry of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus into porcine alveolar macrophages. Journal of Virology77 (15):8207-8215.
[0169] Vinson M, Vandermerwe PA,Kelm S, May A, Jones EY, Crocker PR. 1996. Characterization of the Sialic Acid-Binding Site in Sialoadhesin by Site-Directed Mutagenesis. Journal of Biological Chemistry 271 (16):9267-9272.
[0170] Welch SKff, Calvert JG. 2010. A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection. Virus Research 154:98-103.
[0171] ffensvoort G,Terpstra C,Pol JMA, ter Laak EA, Bloemrad M, de Kluyer EP，Kragten C,van Buiten L，den Besten A,ffagenaar F，Broekhuijsen JM，Moonen PLJM, Zetstra T, de Boer EA,Tibben HJ, de Jong MF, van't Veld P, Groenland GJR, van Gennep JA, Voets MTH, Verheijden JHM，Braamskamp J. 1991. Mystery swine disease in The Netherlands:the isolation of Lelystad virus.Veterinary Quarterly 13:121-130.
[0172] Wills Rff, Zimmerman JJ，Yoon KJ, McGinley MJ, Hill HT, Piatt KB，Christopherhennings J，Nelson EA. 1997. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus-a Persistent Infection. Veterinary Microbiology 55 (1-4):231-240.
[0173] ffissink EHJ, van ffijk HAR,Pol JMA, Godeke GJ, van Rijn PA, Rottier PJM，Meulenberg JJM.2003. Identification of porcine alveolar macrophage glycoproteins involved in infection of porcine respiratory and reproductive syndromevirus.ArchivesofVirology148 (1):177-187.
[0174]YoonIL,JooHS,ChristiansonWE,MorrisonRB,DialGD.1993.Persistentand contactinfectioninnurserypigsexperimentallyinfectedwithPRRSvirus.Swine HealthandProduction1:5-8.
[0175] 介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词"一个（a)"、"一种（an)"、"所述 (the) "和"所述（said) "旨在指有一个或多个要素。术语"包含"、"包括"和"具有"旨在为 包容性并且指可能有除所列要素外的附加要素。
[0176] 鉴于上述情况，可见实现了本发明的几个目标并且获得了其它有利结果。
[0177] 因为在不背离本发明范围的前体下可对以上产物和方法做各种变化，意图是应将 以上描述中所含和附图所示的所有问题均解释为说明性而非限制意义。
【主权项】
1. 一种产生其中⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法， 所述方法包括： 为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失 活的⑶163等位基因；和 激活所述卵母细胞以产生胚胎。2. 权利要求1所述的方法，进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所述代 孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其基因组包含至少一个 失活的⑶163等位基因的经基因修饰的猪。3. -种产生其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方 法，所述方法包括： 为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失 活的SIGLEC1等位基因；和 激活所述卵母细胞以产生胚胎。4. 根据权利要求3所述的方法，进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所 述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其基因组包含至少 一个失活的SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪。5. -种产生其中⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，所述 方法包括： 使通过根据权利要求1或2所述的方法产生的经基因修饰的母猪与通过根据权利要求 1或2所述的方法产生的经基因修饰的公猪交配以产生Fl子代； 筛选所述Fl子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。6. -种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，所 述方法包括： 使通过根据权利要求3或4所述的方法产生的经基因修饰的母猪与通过根据权利要求 3或4所述的方法产生的经基因修饰的公猪交配以产生Fl子代； 筛选所述Fl子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的 猪。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中已经通过部分或完全删除使所述至少 一个等位基因失活。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中已经使用Cre-Iox重组系统使所述至 少一个等位基因失活。9. 根据权利要求3、4、6-8中任一项所述的方法，其中已经通过删除外显子1的一部分 和所有外显子2和3使所述SIGLEC1等位基因失活。10. 根据权利要求1、2、5、7、8中任一项所述的方法，其中已经通过用⑶163L的清道夫 受体富半胱氨酸（SRCR)结构域8置换外显子7使⑶163等位基因失活。11. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述去核在显微操作培养基中用微 量移液管进行。12. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述融合在融合培养基中进行。13. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中激活所述卵母细胞包括在硫柳汞的 存在下培养所述卵母细胞。14. 根据权利要求2或4所述的方法，其中所述转移包括通过代孕体的卵巢伞将所述胚 胎转入输卵管。15. -种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失 活的经基因修饰的猪的方法，所述方法包括： 使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪与其中⑶163 基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪交配或使其中SIGLEC1基因的至 少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪与其中⑶163基因的至少一个等位基因已 经失活的经基因修饰的母猪交配以产生Fl子代； 筛选所述Fl子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且⑶163 基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪； 使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且⑶163基因的至少一个等位基 因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代；并且 筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位 基因已经失活的经基因修饰的猪。16. 权利要求15的方法，其中通过以下的方法产生其中SIGLEC1基因的至少一个等位 基因已经失活的经基因修饰的猪： 为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失 活的SIGLEC1等位基因；和 激活所述卵母细胞以产生胚胎。17. 权利要求16的方法，其中该方法还包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所 述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩所述胚胎产生其基因组 包含至少一个失活的SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪。18. 权利要求15的方法，其中通过以下的方法产生其中CD163基因的至少一个等位基 因已经失活的经基因修饰的猪： 为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失 活的⑶163等位基因；和 激活所述卵母细胞以产生胚胎。19. 权利要求18所述的方法，其中该方法还包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道的方 法产生，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其 基因组包含至少一个失活的⑶163等位基因的经基因修饰的猪。20. -种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失 活的经基因修饰的猪的方法，所述方法包括： 使其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪与其中⑶163基因 的两个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪交配或其中SIGLEC1基因的两个等位基因 已经失活的经基因修饰的公猪与其中⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰 的母猪交配以产生Fl子代； 使所述Fl子代交配以产生F2子代；并且 筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位 基因已经失活的经基因修饰的猪。21. 权利要求20的方法，其中通过下述方法产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因已 经失活的经基因修饰的猪，所述方法包括： 使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪与其中 SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪交配以产生Fl子代；并且 筛选所述Fl子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的 猪。22. 权利要求21的方法，其中通过下述方法产生其中SIGLEC1基因的至少一个等位基 因已经失活的经基因修饰的猪，所述方法包括： 为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失 活的SIGLEC1等位基因；和 激活所述卵母细胞以产生胚胎。23. 权利要求22所述的方法，其中该方法还包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道的方 法产生，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其 基因组包含至少一个失活的SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪。24. 权利要求20的方法，其中通过下述方法产生其中⑶163基因的两个等位基因已经 失活的经基因修饰的猪，所述方法包括： 使其中⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪与其中⑶163基 因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪交配以产生Fl子代；并且 筛选所述Fl子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。25. 权利要求24的方法，其中通过下述方法产生其中⑶163基因的至少一个等位基因 已经失活的经基因修饰的猪，所述方法包括： 为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失 活的⑶163等位基因；和 激活所述卵母细胞以产生胚胎。26. 权利要求25所述的方法，其中该方法还包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道的方 法产生，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其 基因组包含至少一个失活的⑶163等位基因的经基因修饰的猪。27. -种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失 活的经基因修饰的猪的方法，所述方法包括： 使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和⑶163基因的至少一个等位基因已经失活 的经基因修饰的猪与另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和⑶163基因的至少一个 等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生Fl子代；并且 筛选所述Fl子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位 基因已经失活的经基因修饰的猪。28. 根据权利要求15-27中任一项所述的方法，其中所述筛选包括使用聚合酶链反应 (PCR)或DNA印迹。29. 权利要求15-27中任一项所述的方法，其中已经通过用⑶163L的清道夫受体富半 胱氨酸（SRCR)结构域8置换外显子7使⑶163等位基因失活。
【专利摘要】本公开涉及经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或CD163基因的至少一个等位基因已经失活。SIGLEC1基因的两个等位基因和/或CD163基因的两个等位基因失活的经基因修饰的猪抗猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。还提供了产生此类转基因猪的方法。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/877
【公开号】CN105112450
【申请号】CN201510463471
【发明人】R·S·普莱特尔, K·韦尔斯, K·惠特沃思
【申请人】密苏里大学管理者
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2012年5月16日
【公告号】CA2836288A1, CN103687482A, EP2709445A1, EP2709445A4, US20140096275, WO2012158828A1