一种河口及近岸海洋环境中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分离筛选及抗生素抗性评估方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境监测技术领域，涉及一种河口及近岸海洋环境中大肠杆菌、金黄 色葡萄球菌分离筛选及抗生素抗性评估方法。该方法适用于近岸海洋、河口、及入海排污口 水体与沉积物样品中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的快速分析及抗生素抗性水平检测。
【背景技术】
[0002] 在环境科学研究及监测领域尚缺乏针对典型病原微生物大肠杆菌与金黄色葡萄 球菌抗生素抗性水平的检测方法。
[0003] 现有的技术主要是通过采用发酵实验与伊红美蓝琼脂或结晶紫中性红胆盐琼脂 相结合的方式，对环境介质中的大肠杆菌进行计数检测；应用Baird-Parker平板和血平板 结合革兰氏染色实验对金黄色葡萄球菌进行计数检测。但由于实验过程繁琐，周期较长， 且需要进行染色镜检、血浆凝固酶试验等多项检测鉴定试验，导致其很难真实有效的反应 环境介质中两类病原微生物的真实丰度水平，更不能评估两类病原微生物的抗生素抗性水 平。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种河口及近岸海洋环境中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分离筛选及 抗生素抗性评估方法，
[0005] 本方法是通过在MI琼脂与VJ琼脂中浸入筛选抗生素（四环素、磺胺、喹诺酮等） 制成敏感的特异性选择琼脂，快速分离并计数河口及近岸海洋环境中抗生素抗性大肠杆菌 (E.coli)与金黄色葡萄球菌（S.aureus)，进而评估其抗性水平。
[0006] 本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的河口及近岸海洋环境中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分离筛选及抗生素抗 性评估方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
[0008] (1)灭菌：
[0009] 实验前，将滤膜放在滤纸之间包好，同牛皮纸包好的滤器与培养皿一起在121°C下 高压灭菌15min，每次过滤不同样品前，用酒精擦洗漏斗顶部并用火焰灼烧，消除样品间干 扰；
[0010] ⑵培养基的制备：
[0011]S. aureus:准确称取60g VJ培养基（Becton Dickinson，New Jersey)，加入1L无 菌水，加热溶解并不断搅拌，煮沸一分钟后灭菌（l〇3Kpa，121°C，15min)，将经过灭菌的培 养基放入45°C ± 1°C的水浴箱冷却并加入20ml (1% )亚碲酸钾，将配制好的培养基分装于 三角瓶中，一部分作为金黄色葡萄球菌筛选VJ琼脂板（不加抗生素），一部分以最低抑菌浓 度浸入抗生素作为抗生素抗性筛选VJ-R琼脂板；
[0012] E.coli :准确称取 36. 5gMI培养基（Becton Dickinson，New Jersey)，加热溶 解于1L无菌水中，煮沸一分钟后灭菌（103Kpa，121°C，15min)，将经过灭菌的培养基放入 45°C± 1°C的水浴箱冷却待用，配制并加入磺吡苄头孢菌素，使其最终浓度为5yg/ml，将 配制好的培养基分装于三角瓶中，一部分作为大肠杆菌筛选MI琼脂板（不加抗生素），一部 分以最低抑菌浓度浸入抗生素作为抗生素抗性筛选MI-R琼脂板；
[0013] (3)抗生素耐药性实验：
[0014] 3. 1水体样品：
[0015] 3. 1. 1根据样品采集区域及污染状况的估计选取合适样品体积，样品初始体积小 于50ml时用磷酸盐缓冲液（0. 1M，pH= 6)补足并依此制成10倍梯度稀释匀液，从制备样 品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min;
[0016] 3. 1. 2选取3个连续稀释度的样品匀液，将均质好的待测液通过无菌的0. 45ym滤 膜，取下滤膜分别平移到凝固好的MI/VJ控制培养皿与MI-R/VJ-R抗性培养皿中，每个稀释 度各做三组平行；
[0017] 3. 1. 3将无抗生素抗性的标准大肠杆菌（ATCC25922)和无抗生素抗性的标准金黄 色葡萄球菌（ATCC25923)菌液稀释到0. 5麦氏比浊度后按照3. 1. 1和3. 1. 2步骤操作并 通过无菌滤膜，平移到MI/VJ(阳性对照）与MI-R/VJ-R(阴性对照）培养板中做为质控对 照组；
[0018] 3. 1. 4每次过滤完样品后，用量筒取100毫升超纯水或生理盐水，并将其倒入漏斗 中冲洗漏斗两次，并用酒精擦洗漏斗顶部并用火焰灼烧，以消除样品间干扰；
[0019] 3. 1. 5持无菌镊子于膜过滤器边缘，轻轻抬起滤膜，然后将滤膜移至琼脂平板上， 滤膜滑到琼脂培养板上，使用滚动动作，以避免在滤膜和底层琼脂之间出现气泡，若在非湿 润区域气泡发生，则重新放置滤膜；
[0020] 3. 1. 6将培养皿翻转放入培养箱在35°C±0. 5°C的条件下恒温培养24-36h，培养 后，将MI培养皿在自然光下对膜上蓝色菌落计数，并在长波紫外下（366nm)重复计数确定 结果，将VJ培养皿在自然光下对膜上灰黑色圆菌落计数；
[0021] 3. 2沉积物样品：
[0022] 3. 2. 1根据样品采集区域及污染状况的估计选取合适样品质量，将称量好的沉积 物样品放入盛有50mL灭菌海水的无菌离心管内，涡旋震荡3分钟后静置1分钟；
[0023] 3. 2. 2将静置1分钟后的待测液通过无菌的0. 45ym滤膜，取下滤膜分别平移到凝 固好的MI/VJ控制培养皿与MI-R/VJ-R抗性培养皿中，每个样品各做三组平行；
[0024] 3. 2. 3将无抗生素抗性的标准大肠杆菌（ATCC25922)和无抗生素抗性的标准金黄 色葡萄球菌（ATCC25923)菌液稀释到0. 5麦氏比浊度后按照3. 1. 1和3. 1. 2步骤操作并 通过无菌滤膜，平移到MI/VJ(阳性对照）与MI-R/VJ-R(阴性对照）培养板中做为质控对 照组；
[0025] 3. 2. 4每次过滤完样品后，用量筒取100毫升的超纯水或生理盐水，并将其倒入漏 斗中冲洗漏斗两次，并用酒精擦洗漏斗顶部并用火焰灼烧，以消除样品间干扰；
[0026] 3. 2. 5持无菌镊子于膜过滤器边缘，轻轻抬起滤膜，然后将滤膜移至琼脂平板上， 滤膜滑到琼脂培养板上，使用滚动动作，以避免在滤膜和底层琼脂之间出现气泡，若在非湿 润区域气泡发生，则重新放置滤膜；
[0027] 3. 2. 6将培养皿翻转放入培养箱在35°C±0. 5°C的条件下恒温培养24_36h，培养 后，将MI培养皿在自然光下对膜上蓝色菌落计数，并在长波紫外下（366nm)重复计数确定 结果，将VJ培养皿在自然光下对膜上灰黑色圆菌落计数；
[0028] (4)数据分析和计算：
[0029] 计算样品中大肠杆菌（E.coli)与金黄色葡萄球菌（S.aureus)丰度及抗性水平应 符合以下基本条件：
[0030] 4. 1平板上总菌落数彡200/plate;
[0031] 4. 2平板上目标菌落数< 100/plate(20~80最佳）；
[0032] 4. 3.大肠杆菌（E.coli)与金黄色葡萄球菌（S.aureus)丰度计算公式：
[0033]
[0035] 4. 4.大肠杆菌（E.coli)与金黄色葡萄球菌（S.aureus)抗生素抗性率计算公式：
[0036]
[0037] 样品采集时，取样工具及相关试剂材料应提前准备、灭菌，水与沉积物样品收集在 无菌的防漏聚丙烯样品容器中，于1_4°C冷藏尽快送回实验室分析，样品应在采集后12小 时内进行分析，单一样品分析过程不超过15分钟。
[0038] 步骤3. 1. 1中，初始体积选择：河口及入海排污口 ：10ml，近岸海洋：300~500ml。
[0039] 步骤3. 2. 1中，样品初始质量选择：河口及入海排污口 ：0. 1~0. 3g,近岸海洋： 0. 3 ~0. 5g。
[0040] MI培养基是利用特定的酶反应，检测水中的大肠杆菌。培养基中含有两种酶底物： MUGal(荧光）和IBDG(颜色），大肠菌群可以产生0 -半乳糖苷酶，和MUGal反应，生成一 种化合物在长波紫外下（366nm)发出荧光；E.coli可以产生葡萄糖苷酶，和IBDG反应， 生成蓝色化合物，自然光下菌落为蓝色。通过在培养基中加入一定浓度的磺吡苄头孢菌素 抑制革兰氏阳性菌和其