一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水稻高氮利用效率基因（NRT1. 1B)的分子标记鉴定方法，属于生 物技术工程领域，专用于水稻高氮利用效率NRT1. 1B基因的水稻资源鉴定和标记辅助育 种。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国水稻种植面积约占粮食作物面积的 30%，产量接近粮食总产量的一半(张佳宇，吉林农业大学，2008)，约为我国60%以上的人 口提供口粮。按照植物学分类划分，我国种植的水稻品种属于亚洲栽培稻。亚洲栽培稻有两 个亚种，即籼亚种和粳亚种(杨有新等，科学通报，2009,（15) : 2212-2218)，它们在形态、发 育与生理等方面都表现出较大的不同特征。从目前来看，粳稻的产量往往不及籼稻，然而前 者食味品质却大都优于后者。随着人们生活水平的不断提高，粳稻凭借较优的食味品质而 更受消费者的青睐，在我国的种植面积逐年扩大。但与籼稻相比，粳稻的低氮肥利用效率成 为制约其种植面积扩大的重要因素。令人兴奋的是，2015年6月8日世界著名杂志《Nature Genetic》在线报道了"一个伟大的发现"，Hu等从籼稻中克隆了一个高氮利用效率NRT1. 1B 基因；试验表明，将NRT1. 1B基因导入粳稻，大大提高粳稻的氮肥吸收率，一半施肥条件下， 与对照相比增产30~33%，氮肥利用效率提高30% ;在正常施氮条件下，增产8~10%，氮肥利用 效率提高约 10%(HuB,etal.，NatGenet, 2015，47(7): 834-838)。NRT1.1B基因在 粳稻氮肥利用效率改良上具有巨大应用价值，相应基因的鉴定方法值得研究探讨。
[0003] 序列分析显示，籼稻野生型NRT1. 1B基因与粳稻突变型nrtl.lb基因在编码序列 (Codingsequence，⑶S)区域第980位存在一个碱基T与C的差异。对于单碱基差异的检 测，最直接的方法就是测序，但存在费用昂贵、操作工序复杂及耗时长等缺点，不利于推广 应用。四引物扩增受阻突变体系PCR(tera_primeramplificationrefractorymutation system-PCR，tera-primerARMS-PCR)是在普通PCR基础上发展起来专门用于单核苷酸多 态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)检测的衍生技术，能对SNP进行分型鉴定， 呈共显性标记特性，是一种简便、快速、低廉检测SNP的方法(管峰等，生命的化学，2004， 24(6) : 514-516)。基于籼稻野生型NRT1. 1B基因与粳稻突变型nrtl.lb基因存在的单核 苷酸差异，结合tera-primerARMS-PCR引物设计原理，本发明开发出了用于鉴定水稻高氮 素利用效率NRT1. 1B基因的分子标记，为相应目的基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育 种中提供重要参考，有利于提尚工作成效。
【发明内容】
[0004] 本发明的技术问题：本发明针对利用测序鉴定NRT1. 1B基因存在的费用昂贵、工 序复杂及耗时长等缺点，根据野生型NRT1. 1B基因与突变型nrtl.lb基因在编码序列⑶S 第980位存在的碱基T与C的差异，结合tera-primerARMS-PCR引物设计原理，开发该基 因的四条特异性引物并于同管PCR反应扩增水稻基因组DNA来准确、快速地鉴定NRT1. 1B 基因的类型，为相应目的基因的资源筛选鉴定和分子标记辅助选择育种提供重要参考。
[0005] 本发明的技术方案：一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法，其特征在 于：使用高氮利用效率NRT1. 1B基因的特异性引物。引物包括四条，序列如下： 正向外引物NRT1. 1B-0-F:5' -GATGGAGGCGATGAGGAAGA-3' ； 反向外引物NRT1. 1B-0-R:5' -GCTGCCAAGAAACACCACAA-3' ； 正向内引物NRT1. 1B-I-F:5' -TCGTGCACAGCCTCCACTTGCTCGACG-3' ； 反向内引物NRT1. 1B-I-R:5' -AGGTCGGCGGCGGAGTCGCCGGCTAT-3'。
[0006] 使用以上所述的四条引物准确、快速鉴定区分NRT1. 1B基因型的PCR分子标记方 法如下： (1)水稻植株基因组DNA的提取：取分蘖期水稻叶片适量，按CTAB方法对DNA进行提 取，具体步骤为：①取约〇. 〇5g新鲜叶片，置于研钵中，加入0. 5ml的CTAB溶液（CTAB-2% (W/V)，NaCl-1. 4Mol/L，EDTA-0. 02M〇1/L，TrisBasic-0.IMol/L，pH=8. 0)进行研磨；_ 将研磨液移入1. 5ml的离心管，在65T下水浴lh，期间摇晃数次；議12000rpm/min离心 8min，回收上清液0. 3ml至灭菌1. 5ml离心管，弃去沉淀；_!:加入苯酸：氯仿：异戊醇溶液 (25:24:1) 0. 3ml，上下颠倒数次，静置lOmin;⑤12000rpm/min离心lOmin，小心吸取上清 0? 2ml至灭菌 1. 5ml离心管；_加入 20y1 的 3Mol/LNaAC(PH=5. 2)，再加入 0? 4ml的-20°C 无水乙醇，-20°C静置lh;議12000rpm/min离心lOmin，弃上清液，加入0? 3ml的70%乙醇 洗涤两次;g将离心管放到超净工作台风干，加入0. 2ml超纯水溶解备用。
[0007] (2)水稻基因组DNA的PCR扩增：将所述的四条引物NRT1. 1B-0-F、NRT1. 1B-0-R、 NRT1. 1B-I-F及NRT1. 1B-I-R加入到同管PCR反应体系对水稻植株的DNA进行扩增； 20yL的PCR反应体系包括：DNA2yL(10~100ng/L)，引物NRT1. 1B-0-F、NRT1. 1B-0-R、 NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R各 0.5yL(2yM/L)，10XTaqBuffer2yL(含Mg2+)， dNTPMixture0.4yL(2. 5mM/L)，TaqDNA聚合酶 0.4 (2500/mL)，ddH20 13.2yL。PCR 反应程序为：先在95°C下预变性5min;然后95°C下变性30s，62°C下退火复性30s，72°C下 延伸lmin，循环31次；然后72°C下再延伸10min，12°C下2min，可将产物取出备用。
[0008] (3)扩增产物的检测：扩增产物在质量比浓度约为3%的琼脂糖凝胶于150V电压 下电泳40min，越华洋的gillgreen核酸染料染色，置于伯乐凝胶成像系统GELDOCXR下观 察、拍照及记载。若同时扩增出368bp和243bp两条特征条带，则为含野生型NRT1.1B基 因的纯合体；若同时扩增出368bp和177bp两条特征条带，则为含突变型nrtl.lb基因的 纯合体；若同时扩增出368bp、243bp和177bp三条特征条带，则为含NRT1.lB/nrtl.lb 基因的杂合体。
[0009] 本发明的有益效果：本发明提供的"一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定 方法"，具有如下优点： (1)本发明提供的分子标记并非与NRT1. 1B连锁的标记，而是基于基因本身的DNA序列 而设计的功能性分子标记，它能直接反映水稻植株的基因型，不会发生类似连锁标记与基 因的遗传交换而导致基因型鉴定的错误。
[0010] (2)本发明提供的分子标记能准确、快速地对水稻高氮利用效率NRT1. 1B基因的 基因类型进行鉴定。
[0011] (3)与测序鉴定相比，本发明采用四条引物同管一步PCR扩增方法对NRT1. 1B基因 的基因型进行鉴定，不仅能高效地区分目的基因的纯合和杂合类型，而且还可以克服费用 昂贵、工序复杂及耗时长等缺点，显得更为高效、快捷且费用低廉，非常适合对大批量水稻 资源及育种材料的鉴定，具有重大的意义和推广价值。
【附图说明】
[0012] 图1鉴定高氮利用效率NRT1. 1B基因分子标记的设计策略 (nrtl.lb代表粳稻突变型基因序列；NRT1. 1B代表籼稻野生型基因序列；对比序列中 标示有下划线的字母表示存在差异的碱基；箭头表示引物位置及扩增方向，NRT1. 1B-0-F 表示正向外引物，NRT1. 1B-0-R表示反向外引物，NRT1. 1B-I-F表示正向内引物， NRT1. 1B-I-R表示反向内引物） 图2分子标记对水稻NRT1. 1B基因的检测 (M: 100bpDNALadder;1 :9311 ;2 :南京 11 ;3 :培矮 64 ;4 :胜利籼；5 :特青；6 :黄华 占；7 :明恢63 ;8 :珍汕97B;9 :日本晴；10 :武运粳7 ;11 :秀水134 ;12 :空育131 ;13 :龙粳 29 ;14 :秀水 114 ;15 :武运粳 23 号；16 :牡丹江 28 ;17 :F1 (9311/ 日本晴);18 :F1 (培矮 64/ 日本晴）；19 :F1 (9311/空育131) ;20 :F1 (南京11/日本晴)。） 图3分子标记对培矮64/武运粳7的F2群体中单株不同基因型的检测 (M:100bpDNALadder;P1:武运粳 7 ;P2 :培矮 64 ;1-18:F2 个体植株。）。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明"一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法"作 进一步的详细说明。
[0014] 下面给出本发明的一个实施例： 1、供试材料： (1) 明确含野生型NRT1. 1B基因的籼稻8份：9311、南京11、培矮64、胜利籼、特青、黄 华占、明恢 63、珍汕 97B(HuB,etal.，NatGenet, 2015，47(7): 834-838); (2) 明确含突变型nrtl.lb基因的粳稻8份：日本晴、武运粳7、秀水134、空育131、 龙粳 29、秀水 114、武运粳 23 号、牡丹江 28(HuB,etal.，NatGenet, 2015，47(7): 834-838)； (3) 明确含NRTl.IB与nrtl.lb基因的亲本杂交的后代FI材料4份：FI(9311/日本 晴)，F1 (培矮64/日本晴)，F1 (9311/空育131)，F1 (南京11/日本晴）； (4) 培矮64/武运粳7杂交的后代F2育种材料。
[0015] 上述材料于2015年4月10日种于贵州省毕节市农业科学研究所水稻科研基地。
[0016] 2、引物设计及合成： 根据Hu(NatGenet. 2015，47(7): 834-838)等的研究结果，野生型NRT1. 1B基因 与突变型nrtl.lb基因⑶S区域的第980位分别存在的碱基T与C的差异，从NCBI网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载NRT1. 1B基因的DNA序列（GenBank:DP000086. 1)， 定位到DNA序列相应的位置，结合专用于检测SNP突变的tera-primerARMS-PCR引物设计 原理，设计用于检测鉴定NRT1. 1B基因的分子标记，标记由4条引物组成，包括内外引物各 2条。
[0017]正向外引物NRT1 ? 1B-0-F:5' -GATG