检测人类idh1基因突变的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人类IDH1 基因突变的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原 发肿瘤的一半，广义上是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义上则是指源于各类胶质细胞的 肿瘤。通用WHO分级根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度分为4级：1级： 以良性毛细胞型星形细胞瘤为主，占胶质瘤5%左右，通常可以治愈；II级：为一般的星形 细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤，占胶质瘤的30~40%左右；III级：为间变型星形细胞 瘤，占胶质瘤的15~25%左右，一般由II级演变而来；IV级：为胶质母细胞瘤，占胶质瘤的 1/3左右。低级别的胶质瘤在临床上主要是指WHO分类为星形细胞瘤I与II级，也包括少 突胶质细胞瘤及混合性少突星形细胞瘤。
[0003] 异柠檬酸脱氢酶（IDH)家族包括以NAD或NADP为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化 脱羧反应生成a-酮戊二酸的酶类，同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中，IDH 同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2,依赖NADP的胞 质IDH3。编码依赖NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色体2q33. 3,并且定位于细胞质和 过氧化物酶体中；编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26. 1。尽管 IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但IDH1在脂质的代谢机制中也发挥了 重要作用。
[0004] 大量研究证实，代谢的异常是引发肿瘤发生、发展的因素之一。IDH基因突变发生 在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH基因高度保持一致。一般认为，IDH基因状态不 会因治疗而发生变化。IDH基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%， 胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。IDH1基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13 密码子R>H(彡90% )称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使 得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络（NCCN)临床实践指南（第二版， 2014)将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别胶质瘤患者风险级别的指标之一。
[0005] 以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体 定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死 等进行分级。当取材为肿瘤（尤其低级别胶质瘤）边缘时，或肿瘤治疗后判断是否存在复 发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。而直接测序法检测 基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。
[0006] 扩增阻碍突变系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)于 1989 年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变特异性ARMS引物，其3'末端碱 基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于 ARMS引物的特异性和反应条件如酶、镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引 物与靶DNA发生错配时的错配延伸，可通过在引物3'端的第2-3个碱基引入另外一个或者 两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。相比于组织病理学诊断方 法，应用ARMS将显著提高IDH1基因突变检测的效率、灵敏度及特异性。
[0007] 荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用最广的技术之一，该方法灵敏度高、可实 时定量，是适合临床大规模使用的方法。IDH1基因序列中GC含量很高，因此片段扩增的难 度很大。
【发明内容】
[0008] 为了克服上述现有技术中的缺陷，同时实现对人类IDH1基因突变的检测并计算 样本的突变率，从而为肿瘤预后判断、靶向用药提供参考，本发明提供了一种检测人类IDH1 基因突变的方法及其试剂盒，该检测方法和应用该方法的试剂盒将特异性引物用于荧光定 量PCR方法中，可以克服IDH1基因序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，对R132H位 点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1%。
[0009] -种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
[0010] (1)在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在IDH1内标反应混合液中加入从 同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩 增，其中：
[0011] 所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 1所示序列的 IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有 荧光染料的PCR预混液；
[0012] 所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1 内标如向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 4所不序列的IDH1内标反向引物和含有焚光染 料的PCR预混液；
[0013] (2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩 增时的突变ct值，然后确定同一样本在内标反应体系的ct值，对ct值进行分析。
[0014] -种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其中：
[0015] 所述在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因 组DNA为：在10yLIDH1R132H反应混合液中加入5yL、浓度为10ng/yL的人类基因组 DNA，其中：在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有 荧光染料的2XPCR预混液的体积比为（1-2) : (1-2) : (7-8)，优选为1.25:1. 25:7. 5;在 IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物的浓度均为2-6yM， 优选4-5yM，更优选4. 8yM;
[0016] 所述在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因 组DNA为：在14yLIDH1内标反应混合液中加入lyL、浓度为10ng/yL的从同一样品 中提取的人类基因组DNA，其中：每14yLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物 0. 3-0. 5yL、IDH1内标反向引物0. 3-0. 5yL和含有荧光染料的2XPCR预混液7-8yL， 不足14yL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14yLIDH1内标反应混合液中有IDH1内 标前向引物〇. 3125yL、IDH1内标反向引物0. 3125yL和含有荧光染料的2XPCR预混液 7. 5yL;在IDH1内标反应混合液中IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物的浓度均为 2-6yM，优选 4-5yM，更优选 4. 8yM。
[0017] -种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其中所述荧光定量PCR方法 的扩增过程为：（1) 95°C、3min、循环数为 1 ; (2) 95°C、15s，68°C、20s，循环数为 18 ; (3) 95°C、 15s，57. 6°C、20s，循环数为 24 ;(4)升温至 95°C。
[0018] -种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其中所述对Ct值进行分析的 步骤为：
[0019] 当样品在R132H反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值19时，则该样品的 R132H突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
[0020] 当样品在R132H反应体系的突变Ct值小于阴性临界值19时，按照以下标准进行 判断：当该样品在R132H反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值16时，则该样品的 R132H突变为阳性，即强阳；当该样品在R132H反应体系的突变Ct值大于阳性临界值16时， 则计算R132H反应体系的ACt，ACt值=R132H反应体系突变Ct值-该样本在内标反应 体系的Ct值，若反应体系的ACt值小于相应的ACtCut-off值9,则该样品的R132H突 变也为阳性，即弱阳，若反应体系的ACt值大于或等于相应的ACtCut-off值9,则该样品 的R132H突变为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。
[0021] -种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，包括IDH1R132H反应混合液，还包括IDH1 内标反应混合液，其中：
[0022] 所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 1所示序列的 IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有 荧光染料的PCR预混液；
[0023] 所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1 内标如向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 4所不序列的IDH1内标反向引物和含有焚光染 料的PCR预混液。
[0024] IDH1基因突变上、下游引物序列
[0025]
[0026] 一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1R132H前向引物、IDH1R132H 反向引物和含有荧光染料的2XPCR预混液在IDH1R132H反应混合液中的体积比为（1-2): (1-2) :(7-8)，优选为 1. 25 :1. 25 :7. 5 ;IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物在 IDH1R132H反应混合液中的浓度均为2-6yM，优选4-5yM，更优选4. 8yM。
[0027] -种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1内标前向引物、IDH1内标反 向引物和含有荧光染料的2XPCR预混液在IDH1内标反应混合液中的体积比为（0. 3-0. 5): (0.3-0.5) :(7-8)，优选为0.3125 :0.3125 :7.5