靶向HER2的人源化改造的可内化单链抗体P1h3及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种抗人HER2单链抗体，特别涉及一种经人源 化改造的可内化的抗人HER2单链抗体，包括其氨基酸序列和核苷酸序列以及抗体制备方 法和其对HER2阳性肿瘤细胞的诊治用途。
【背景技术】
[0002] HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,ErbB2/P185)是人表皮生长 因子受体（EGFR)家族的第二个成员，由原癌基因erbB2/Her2编码，编码基因定位于人染色 体17q21，分子量为185kDa，是一种酪氨酸激酶受体膜糖蛋白。HER2通过与HER1，HER3或 HER4形成异二聚体，导致下游MAPK和PI3K等信号通路活化，过度传导生长信号从而导致细 胞恶性增殖。在人类多种肿瘤中，包括25-30 %乳腺癌、35-45 %胰腺癌及90 %的结肠直肠 癌、16-57 %的非小细胞肺癌、9-38 %的胃癌等都发现有HER2原癌基因扩增或者蛋白过表 达现象，临床上称为J1ER2阳性肿瘤，主要表现为肿瘤恶性程度高，易进展及转移，对放化疗 不敏感，易复发，患者生存期短。
[0003] 1975年，Kohler与Milstein发明了用来制备单克隆抗体（Monoclonalantibody， mAb)的杂交瘤技术，之后单抗药物迅速发展并应用于临床。近年来，祀向HER2的抗体药 物也已经成为HER2阳性肿瘤治疗新热点。曲妥珠单抗（赫塞汀，英文名Trastuzumab/ Herceptin)是Genetech公司开发的抗HER2人源化单克隆抗体药物，美国FDA于1998年 批准上市，目前曲妥珠单抗联合化疗药物（紫杉醇等）已经成为HER2过表达晚期转移性 乳腺癌和晚期胃癌的一线治疗方案，在J1ER2阳性转移性乳腺癌的治疗中，临床有效率可达 38%，欧洲EMEA已经批准Trastuzumab联合化疗药物作为治疗HER2阳性进展期胃癌的一 线治疗方案。
[0004] 尽管Trastuzumab的临床应用取得了令人鼓舞的结果，但仍有大量病人对治疗无 反应，或治疗后复发。有研究报道鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，可引起机体 免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体（Humananti-mouseantibody， HAMA)反应，重复使用时甚至可导致病人严重的过敏性休克。而且由于HAMA的存在，鼠 单抗在人体内会很快得到清除，半衰期很短，因此限制了其临床应用。Trastuzumab为人 鼠嵌合抗体，但其可变区部分为鼠源性，会引发人体产生HAMA，有转移性乳腺癌长期应用 Trastuzumab治疗的研究报告指出大约有25%的病人出现过心脏毒性；临床III期试验结果 表明，HER2阳性乳腺癌病人只有大约1/3对Trastuzumab单剂治疗有确切的疗效；在临床， 即使联合化疗，大多数病人在使用Trastuzumab治疗一年内就会产生耐药。
[0005] 随着对各类抗体结构和功能之间关系的深入了解，利用抗体工程技术对抗体结构 进行改造，将动物来源的单克隆抗体人源化（Monoclonalhumanization)，以降低这些单抗 反复应用于人体后产生的免疫原性使之用于人类疾病的治疗，是目前研究的一个热点。抗 体人源化改造的主要策略有以下几种：
[0006] 1 ?嵌合抗体
[0007] 抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性最强的部位，运用基因工程技术将鼠单 抗可变区与人抗体的恒定区相拼接，即成为鼠单抗人源化的最简单形式人/鼠嵌合抗体 (chimericantiboay)。嵌合抗体大大降低了鼠源单抗的免疫原性，同时又保留了鼠单抗的 亲和性及特异性。由于嵌合抗体仍保留了原来鼠源抗体约30%左右的鼠源序列，其免疫原 性虽有所降低，但仍可引起不同程度的HAMA反应。
[0008] 2?互补决定区（complementarydeterminingregion，Q)R)移植的人源化抗体
[0009] 每一抗体分子Fab段的轻、重链可变区各具有3个抗原互补决定区（⑶R1XDR2和 Q)R3)，它们之间有起结构稳定作用的框架区（frameworkregion，FR)，CDR可直接接触抗 原，决定抗体的特异性，FR作为支持CDR的支架其立体构象极为保守。CDR移植抗体是把鼠 单抗的互补决定区（CDR)移植到人单抗的骨架区FR构建而成的抗体，经临床试验证明，其 免疫原性得到显著降低。
[0010] 3.人源FR模板的重构
[0011] ①模板替换，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠mAbFR有最大同源性的人源FR用 以替换。轻、重链通常来自不同的人抗体，这样可使鼠源CDR和人模板间有更好的同源性。 应将鼠FR中与CDR密切相关的氨基酸残基保留在替换的人源FR中。为了保持CDR的空间 构象，要特别注意原始抗体CDR下面的堆积残基以及CDR周围的残基。②补偿变换，补偿变 换可以认为是模板替换的进一步延伸，在人FR选择上，将与CDR有相互作用、与抗体亲和力 有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全CDR移植。③定 位保留，最简位置模板（minimalpositionaltemplate)能确认在抗体可变区中哪些位置 是保持抗体的抗原结合结构域完整性所必需的，在选择用于人源化的人FR时，首先从现有 的人源抗体保守序列中搜寻与鼠FR最相似的序列；其次根据最简位置模板确定鼠可变区 的关键位置残基；最后保留所有这些位置而将其余部分人源化。
[0012] 4?表面重塑
[0013] 将非人源单抗可变区（Fv)表面非人源的氨基酸残基替换为人源性的氨基酸残 基，使非人源抗体Fv区的表面人源化，降低其免疫原性，同时不影响Fv区的整体空间构 象，从而保留其抗原结合部位的结构。
[0014] 5?抗原表位定向选择（epitope-guidedselection)
[0015] 将鼠抗体的轻链或重链文库与人抗体的重链或轻链文库配对，构建成"人一鼠杂 合抗体库"，筛选与抗原结合的克隆，分离获得人抗体的重链或轻链基因，再将它们与人的 轻链或重链文库混合，用抗原筛选，就能得到与抗原结合的特异性人抗体。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的在于提供一种靶向HER2的人源化改造的可内化单链抗体Plh3及其 制备方法和应用。
[0017] 本发明公开的一种靶向HER2的人源化改造的可内化单链抗体Plh3,其氨基酸序 列如SEQ.ID.NO. 1所示。
[0018] 本发明还公开了编码人源化改造的可内化单链抗体Plh3的核苷酸序列，如SEQ. ID.NO. 2 所示。
[0019] 本发明还公开了一种制备靶向HER2的人源化改造的可内化单链抗体Plh3的方 法，包括以下步骤：
[0020] 1)将鼠源性单链抗体e23sFv的CDR移植到同源性最高的人抗体共有序列的FR;
[0021] 2)将FR中对维持抗体空间构象的13个氨基酸残基突变为e23sFv中的鼠源性氨 基酸残基，构建库容量为213单链抗体噬菌体展示库；
[0022] 3)从得到的单链抗体噬菌体展示库筛选出具有高亲和活性及高内化活性的人源 化单链抗体Plh3。
[0023] 本发明还公开了上述的革El向HER2的人源化改造的单链抗体Plh3在制备抗肿瘤药 物和/或保健品中的应用，以及靶向J1ER2的人源化改造的单链抗体Plh3在制备HER2阳性 肿瘤诊断试剂中的应用。
[0024] 所述的药物和/或保健品为抗HER2阳性肿瘤细胞的药物和/或保健品。
[0025] 所述HER2阳性肿瘤细胞为乳腺癌细胞、胃癌细胞、非小细胞肺癌细胞或卵巢癌细 胞等。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0027] 1、本发明首次对免疫促凋亡分子Immuno-Fdt-tBid单链抗体部分e23sFv进行了 人源化改造，e23是HER2分子胞外段免疫小鼠后制备的杂交瘤中亲和力及抑制肿瘤效率最 好的克隆，对e23的单链抗体形式e23sFv的人源化改造尚属首次。
[0028] 2、将与e23sFv的VL、VH同源性最高的人源抗体共有序列FR与e23sFv的FR进行 替换，同时挑选对抗体构象起重要作用的13个FR位点，突变为原来e23sFv的氨基酸残基， 以最大限度保证单链抗体构象的正确折叠。
[0029] 3、构建库容量为213的突变体单链抗体库，利用噬菌体展示技术筛选出对HER2亲 和力高的人源化单链抗体株Plh3,保证经过人源化改造的单链抗体能够具有较高的亲和 力。
[0030] 4、利用多种实验手段从分子到细胞水平验证经人源化改造的Plh3对HER2分子的 亲和活性及内化进入HER2阳性肿瘤细胞的活性，比较其与鼠源单链抗体e23sFv免疫原性 的大小，确保最后筛选的分子具有较高的亲和、内化活性及较低的免疫原性，为进一步构建 靶向HER2分子的免疫促凋亡分子，并实现在临床的应用奠定基础。
【附图说明】
[0031] 图1为完全人源化单链抗体hue23sFv氨基酸序列构建流程框图；
[0032] 图2为人源化单链抗体突变体的突变引物序列结果；
[0033] 图3为多位点突变PCR凝胶电泳结果图；
[0034] 图4为人源化单链抗体噬菌体抗体库的构建及4轮淘选结果图；
[0035] 图5为PhageELISA筛选亲和力最高的单链抗体株结果；
[0036] 图6为4株人源化单链抗体的原核表达及纯化结果；
[0037] 图7为SPR测定人源化单链抗体对重组人HER2分子亲和常数；
[0038] 其中（a)为e23sFv对重组人HER2分子的亲和常数KD4. 512*10SM; (b)为Plh3 对重组人HER2 分子的亲和常数KD4. 787*101QM; (c)为e23sFv、Plh2、Plh3、P2h2、P2h5 对 重组人HER2分子的结合解离能力分布。
[0039] 图8为ELISA测定人源化单链抗体对重组人HER2分子的亲和活性；
[0040] 图9为流式细胞术检测人源化单链抗体对HER2阳性肿瘤细胞结合的特异性；
[0041] 图10为激光共聚焦显微镜检测人源化单链抗体内化进入HER2阳性肿瘤细胞活 性；
[0042] 其中，（a)为e23sFv、Plh3内化进入HER2阳性乳腺癌细胞BT-474 ; (b)为e23sFv、 Plh3内化进入HER2阳性卵巢癌细胞SK0V-3 ; (c)为e23sFv、Plh3不能内化进入HER2阴性 乳腺癌细胞MCF-7。
[0043] 图11为ELISP0T检测人源化单链抗体的刺激人PBMC产生IFN-y的水平；
[0044] 图12为人外周血多细胞因子检测评价人源化单链抗体免疫原性结果；
[0045] 其中，（a)为e23sFv、Plh2、Plh3、P2h2、P2h5 刺激健康人PBMC分泌TNF-a的水 平；（b)为e23sFv、Plh2、Plh3、P2h2、P2h5 刺激健康人PBMC分泌IFN-y的水平；（c)为 e23sFv、Plh2、Plh3、