一种用于富集与分离糖蛋白的分子印迹复合材料的制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明公开了一种用于富集与分离糖蛋白的分子印迹复合材料的制备方法，属于材料科学与工程和生物分离工程领域。
【背景技术】
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[0002]糖蛋白是生物体内一类比较常见的蛋白质，具有重要的生物学功能和临床意义。糖蛋白在生理过程中具有重要作用，如分子识别、免疫应答及发育调控等，而且很多疾病的发生都与糖蛋白的表达有关，因此很多糖蛋白已经被用作临床诊断的疾病生物标记，用于重大疾病的早期诊断，如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病及糖尿病等。胚胎抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和前列腺特异抗原(PSA)等常见的疾病标志物都是糖蛋白。然而糖蛋白在体内的浓度较低，直接检测很容易受到干扰，因此一般对糖蛋白的检测需要有分离富集过程。目前，常用的凝集素和抗体是糖蛋白识别、纯化、分离的重要手段，然而它们有着价格昂贵、易失活以及与目标蛋白结合后洗脱困难等苦难，其他富集分离方法，例如尺寸排阻色谱、酰肼化学等，通常耗时耗力。因此，发展一种能够专一识别糖蛋白的价廉、稳定、洗脱方便、富集能力强的方法具有重要的应用前景。
[0003]分子印迹聚合物是将功能单体和交联剂围绕模板分子交联聚合而成的人工受体，在洗脱掉模板分子后，在其体内留下了与模板分子在尺寸大小、空间结构和结合位点互补的空穴，从而可用于模板分子的分离、富集及检测等。分子印迹聚合物不仅对目标分子具有较好的识别能力，还具有合成简单、成本低、稳定性好和可再生等优点。虽然分子印迹技术在小分子的印迹方面取得很大的进步，在对大分子特别是蛋白质的印迹方面还存在很多困难，这主要是因为蛋白质体积相比小分子化合物大，分子结构较为复杂，存在构象的差异变化，以及传统的分子印迹制备方法以有机相为溶剂，蛋白溶解性较差且容易失活等原因。为了解决这些问题，已发展出多种适用于蛋白质的分子印迹技术，如表面印迹法、纳米技术印迹、金属配位印迹法等。
[0004]表面分子印迹通过将分子识别位点设计在印迹材料表面或接近表面的地方，从而提升了识别位点与目标分子之间的传质作用，有利于模板分子的洗脱和再结合。石墨烯具有极高的比表面积、高热导率、快速的电子传递速率、良好的生物相容性及优良的机械性能等，是制备分子印迹材料很好的载体。以石墨烯为载体的分子印迹聚合物，功能单体的聚合过程发生在石墨烯片材的表面，制得的MIPs有极大的表面积，同时，识别位点分布于MIPs片层材料表面，能够有效的提高模板分子的吸附容量。不过石墨烯表面呈惰性，与蛋白质的亲和力有限，不利于蛋白质在其表面的结合与负载。最近，有研究发现在碱性条件下，苯硼酸结构可以和糖蛋白中的顺式二醇结构发生可逆的反应生成硼酸酯结构，形成稳定的苯硼酸.糖蛋白络合物，而在酸性条件下，硼酸酯键发生断裂，该苯硼酸.糖蛋白络合物破裂，释放出糖蛋白。这就使得苯硼酸修饰的分子印迹聚合物可以实现对糖蛋白的专一性识别及富集分离。并且，利用苯硼酸修饰的分子印迹聚合物对糖蛋白具有较高的亲和力，可以增强对特定糖蛋白质的选择性，并且，可以利用PH容易地控制结合/解吸过程。
[0005]
[0006]本专利我们将以糖蛋白作为模板，结合表面印迹技术、纳米材料(石墨烯)与苯硼酸-糖蛋白亲和作用制备分子印迹复合材料，以石墨烯作为表面印迹聚合物的载体能够使结合位点位于材料表面并大大增加印迹比表面积，有利于提高结合容量和结合速度，另外氧化石墨烯表面硼酸基团的存在为糖蛋白提供了更有效的结合位点，特异性识别能力能够得到显著的提高，因此所得到的分子印迹复合材料同时具有专一性识别能力、抗干扰能力强、结合容量高、结合和洗脱速度快的优点，从而实现对复杂的实际样品中低浓度糖蛋白的富集与提纯。
【发明内容】
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[0007]本发明的目的是提供一种糖蛋白分子印迹复合材料的制备方法及其在天然低含量糖蛋白纯化领域的应用。该制备方法将表面印迹技术、纳米材料(石墨烯)与苯硼酸-糖蛋白亲和作用相结合，利用糖蛋白为模板，硼酸基功能化石墨烯为载体，制备分子印迹复合材料。所制备的印迹材料对目的糖蛋白具有特异性识别的特点，能够实现对目的糖蛋白高通量和特异性的结合，可用于复杂的实际样品中低浓度糖蛋白的富集与提纯。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0009](I)硼酸基功能化石墨烯的合成
[0010]将氧化石墨烯溶于去离子水中，超声分散，得到氧化石墨水溶液，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌20-40min后，加入3-氨基苯硼酸单水合物(APBA)，室温搅拌18_36h后，抽滤，分别用乙醇和水洗涤，抽滤、真空干燥得到硼酸基功能化的氧化石墨烯；
[0011](2)分子印迹复合材料的制备
[0012]将上一步中所得到的硼酸基功能化石墨烯分散在含有模板糖蛋白的PBS(pH =
6.5?8.5)缓冲溶液中，室温下反应6?12h，使糖蛋白充分组装到硼酸基功能化氧化石墨烯表面，然后加入丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧，再加入过硫酸铵和N，N，N’，N’ -四甲基二乙胺，18?25°C交联反应20?30h，离心分离洗涤，最后用醋酸和醋酸钠的混合液(pH = 2.5?4.5)洗脱模板分子，得到蛋白质印迹复合材料。
[0013]步骤⑴中所述的氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1?5mg/mL，超声时间为30?120min，氧化石墨烯、3-氨基苯硼酸单水合物、1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1: 10: 6: 6?1: 3: 2: 2。
[0014]步骤(2)中所述的硼酸基功能化氧化石墨烯与模板糖蛋白的质量比为1: 5?
2: 1，丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为12:1?6: 1，过硫酸铵和N，N，N’，N’ -四甲基二乙胺的质量比为25:1?10: 1，硼酸基功能化氧化石墨烯、丙烯酰胺和过硫酸铵的质量比为5: 3:1?1: 3:1。
[0015]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0016]本发明不同于其他蛋白质印迹方法，其一是利用石墨烯作为载体材料，极大地提高了印迹表面积，增加了印迹位点和吸附效率，提高了结合和洗脱速度；其二是在石墨烯表面引入了与糖蛋白具有强亲和作用的硼酸基元，可以增强对特定糖蛋白质的选择性，使该体系对目标糖蛋白具有更强的特异性识别能力，提高其抗干扰能力；其三是整个制备过程都是在水相中室温下进行，有利于保持蛋白质的天然结构。该技术所制备的分子印迹复合材料不仅能在高丰度非糖蛋白的干扰下选择性富集低丰度糖蛋白，使其在总蛋白质中的含量提高了 200多倍，还能通过调节pH值来调节印迹材料与模板分子间的作用强度。另外，所得到的印迹材料还具有有效印迹位点多，印迹效率高，结合容量大，结合和洗脱速度快的优点。
【具体实施方式】
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[0017]以下所列实施例和应用例是为更具