新颖牛樟芝分离株和其培养产物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种牛樟芝（Antrodiacinnamomea)的新颖分离株、培养所述分离株 以获得含有大量2, 3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌（DMB)、4, 7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯 并间二氧杂环戊烯（SY-1)和5-甲基-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-4, 7-二醇（MBDD)的 培养产物的方法，以及包含所述培养产物的组合物。本发明还有关从所述培养产物中制备 DMB、SY-1和/或MBDD的方法。
【背景技术】
[0002] 牛棒芝（Antrodiacinnamomea)(张T.T. (Chang，T.T.)等人，1995?真菌学研 究（MycologicalResearch)99:756-758)是仅生长于牛樟树的台湾特有真菌，由于含有腺 苷（adenosine)、多醣类（polysaccharides)(陈J.J. (Chen,J.J.)等人，2007?天然产物 杂志（JournalofNaturalProducts) 70 :989_992)、三廠类化合物（triterpenoids)(陈 C.H. (Chen，C.H.)等人，1995.天然产物杂志 58 :1655-1661 ;成I.H. (Cherng，I.H.)等人， 1995.天然产物杂志 58 :365-371 ;和成I.H.等人，1996?植物化学（Phytochemistry)41 : 263-267)、固醇类（李I.H. (Lee，I.H.)等人，2002?欧洲微生物学会联合会微生物学快报 (FEMSMicrobiologyLetters) 209 :63-67)、双萜类（李Z.H. (Lee，Z.H.)等人，2007?药 用植物（PlantaMed.) 73 :1412-1415)、倍半萜类（利恩H.M. (Lien，H.M.)等人，2011?循 证补充替代医学（Evid.BasedComplementaryAltern.Med.) 2011 :1_10.)、苯环类（中村 N. (Nakamura,N.)等人，2004.天然产物杂志67:46-48)和酸类等具生理活性的成分，被认 为具有抗肿瘤、增加免疫力、降高血压、降血糖、抑制血小板凝集、抗病毒、抗细菌、保护肝脏 等功能。
[0003] 先前文献TWI417380B揭示牛樟芝的演化分类、型态特征、生理活性和菌种鉴定方 法，其全文内容并入本文以供参考。
[0004] 牛樟芝具有多种生理活性，相关产品深受消费者青睐，但由于野生牛樟芝生长缓 慢，无法满足市场需求，因此开发人工培养的牛樟芝产品有其必要性。目前市售牛樟芝产品 依原料的不同，可以区分为野生牛樟芝子实体、人工栽培牛樟芝子实体、牛樟芝太空包和 牛樟芝菌丝体（固体或液体发酵）等类别。人工栽培生产牛樟芝子实体所需时间长达18 个月至36个月，固液体发酵培养的菌丝体生产时间则只需1-3个月。因此短时间即可收成 的固液体发酵菌丝体产品渐渐已经成为市场上主流。
[0005] 牛樟芝菌株是生产牛樟芝产品的核心重点，但不同菌株的功效活性差异极大，因 此筛选取得优良牛樟芝菌株极为重要。香杉芝可以产生的活性代谢物中DMB具有抑制血 管新生的活性（陈劲初等人，2012,台湾专利1369201)，SY-1具有抑制人类结肠细胞的增 殖的活性（利恩H.M.等人，2011.循证补充替代医学2011 :1-10)和治疗肠癌的效果（涂 S.H. (Tu，S.H.)等人，2012?农业食品化学杂志（JAgricFoodChem.) 60 (14) :3612-8)，并且 MBDD则具有抗氧化活性（吴M.D. (Wu，M.D.)等人，2011.天然产物研究（NaturalProduct Research)，25 (16) : 1488-1496)。因此，可以制备高产量DMB、SY-1和/或MBDD的牛樟芝菌 株的寻求，在商业上具有极重要的价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种牛樟芝分离株，其可以同时制备高产量DMB、SY_1 和 MBDD。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种培养所述牛樟芝分离株以获得含有高量DMB、 SY-1和MBDD的培养产物的方法。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种由上述方法所获得的含有高量DMB、SY-1和 MBDD的培养产物。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种包含所述含有高量DMB、SY_1和MBDD的牛樟芝 培养产物的组合物。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种由所述含有高量DMB、SY-1和MBDD的牛樟芝培 养产物制备分离DMB、SY-1和/或MBDD的方法。
[0011] 本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的和优点可易见于本发明 的实施方式和权利要求书中。
【附图说明】
[0012] 图1显示将18株牛樟芝菌株rDNA的ITS序列和LSU D1-D3序列合并后，以MP法 分析构筑的亲缘演化树，BCRC36937香杉芝为外群。
【具体实施方式】
[0013] 本发明可以通过下述实施方式中所揭示的各种发明方面、实施例和表列的相关叙 述所了解。除非在本文中另作定义，否则与本发明关联使用的术语（包含技术和科学术语） 应具有本发明所属领域的技术人员所了解的含义。并且应当可以了解，除非本文中提供的 定义另作说明，否则在任何潜在歧义的情况下，术语的定义应与所述普遍使用的术语（如 词典中所定义）一致。可以进一步了解者，本案所使用的术语仅用作描述特定实施方面的 目的，而非用于限定。
[0014] 必须注意的是，除非有清楚的相反指示，否则于说明书或权利要求书使用的单数 格式"一种""和"所述"包含复数表示。因此，除非上下文另有需要，否则单数术语应包含 复数而复数术语也包含单数。
[0015] 本发明的范围以"从一"约"特定数值和/或至另一"约"特定数值"表示。当范围 由上述方式表示时，其包含自一特定数值和/或至另一特定数值的范围。同样地，当数值可 以通过术语"约"以表示近似值，将可以了解其为一个特定值的另一个方面。可以进一步了 解，当提及有关其它端点和其它端点本身而言，每一范围的两端点皆是有意义的。根据本发 明"约"表示±10%。
[0016] 于本发明中，术语"经分离"或"分离"意味着将物质从其原始环境（例如，若天然 存在则是天然环境）中移出。术语"经分离"或"分离"并不一定指物质是经纯化的。
[0017] 本发明的目的一在于提供一种牛樟芝分离株，其包含如SEQ ID N0 :1所不核苷酸 序列的ITS序列和如SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列的LSU D1-D3序列。
[0018] 在本发明的一个优选实施方面中，所述牛樟芝分离株是寄存于财团法人食品工业 发展研究所并且寄存编号为BCRC930164的菌株，或是与寄存于财团法人食品工业发展研 究所并且寄存编号为BCRC930164的菌株具有实质上完全相同特征的突变株。
[0019] 上述"变异株"意味着涵盖全体细胞遗传组成已通过如化学突变诱发、自发突变、 遗传工程、转化或转染而改变，以致影响其物理或生物化学特性的任何牛樟芝菌株。然而， 所述突变株应具有以寄存编号为BCRC930164寄存于财团法人食品工业发展研究所的菌株 的所有识别特征。
[0020] 本发明的另一个目的在于提供一种制备牛樟芝培养产物的方法，其包含将本发明 的牛樟芝分离株接种于适合培养基中，和在适当条件下进行培养以获得所述培养产物。本 发明还提供由上述方法所获得的培养产物。
[0021] 本发明中所述用于培养牛樟芝分离株的"适合培养基"可以是任何习知用于培养 牛樟芝的液体培养基或固体培养基。而且，本发明中用于培养牛樟芝分离株的"适当条件" 是指如温度和培养时间等条件，其可以容许所述牛樟芝分离株生长、繁殖并制造DMB、SY-1 和MBDD。所属领域的技术人员可以根据既有知识针对培养基的成分和培养条件作调整。根 据本发明，培养方式可以是任何习知的固体发酵或液体发酵（例如批次发酵、馈料批次发 酵和连续发酵）。
[0022] 适用于本发明的液体培养基可以是，但不限定为马铃薯液体培养基（Potato DextroseBroth，F*DB)(美国迪夫科（Difco，USA))和麦芽萃取物培养基（MaltExtract Broth，MEB)(美国迪夫科）。适用于本发明的固体培养基可以是，但不限定为以谷物为基础 的固体培养基或以食品工业副产物为基础的固体培养基。
[0023] 本发明所述的"以谷物为基础"或"以食品工业副产物为基础"的固体培养基是 指所述固体培养基中的主要成分（重量比约90%以上）是谷物或食品工业副产物，并且其 中尚可以包括任何习知用于培养牛樟芝的组成分，例如氮源（如酵母萃取物、蛋白胨、氯化 铵、硝酸铵、亚硝酸铵和氨基酸）；碳源（如葡萄糖和甘油、淀粉、蔗糖、果糖）；盐类（如钠 盐、钾盐和镁盐）和缓冲剂（如磷酸缓冲剂）。在本发明中，所述谷物包括，但不限定为米、 大麦、荞麦、高粱、薏仁、小麦、黑麦、燕麦或其组合；并且所述食品工业副产物包括，但不限 定为蔗渣、淀粉、麸皮、米糠、玉米杆、咖啡渣或其组合。
[0024] 在本发明的一个实施方面中，在以米为基础的固体培养基中培养所制备的牛樟 芝培养产物中，以所述牛樟芝培养产物的总重量计，2, 3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌 (01?)、4,7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯并间二氧杂环戊烯（3丫-1)和5-甲基-苯并[1， 3]间二氧杂环戊烯_4,7_