一种基于初次卵裂时间和囊胚基因表达水平筛选检测山羊克隆胚胎质量的相关基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于初次卵裂时间和囊胚基因表达 水平筛选检测山羊克隆胚胎质量的相关基因的方法。
【背景技术】
[0002] 克隆（体细胞核移植）技术能将体细胞在体外去分化，发育成具有全能性的胚胎， 这在临床上有巨大的应用前景。然而，SCNT技术过程复杂、影响因素多，通过SCNT技术获 得出生个体的效率也非常低，严重制约转基因大家畜的研究与应用。研究发现，缺乏有效的 胚胎评估体系，不能筛选出优质的移植胚胎是影响SCNT效率低下的主要原因之一。因此， 寻找一种更为客观、全面的评估胚胎质量和发育潜能的方法，筛选优质胚胎进行移植至关 重要。
[0003]当前胚胎的评估手段主要是直观的形态学观察，依据胚胎卵裂球数目、碎片程度 及均等性可以评估胚胎质量。虽然形态学方法无创、方便、快速，但缺乏统一标准，并且不能 准确反映胚胎的功能状态，观察者间的主观性使卵子与胚胎发育的关联显示出差异性。另 外，形态正常的胚胎也可能存在遗传或表观遗传缺陷。前期有研究表明：胚胎培养过程中， 早期卵裂胚胎相对于晚期卵裂的胚胎更容易发育到囊胚阶段。Edward等研究发现受精卵卵 裂时间与怀孕率有关，Van Montfoort等发现，早卵裂胚胎的怀孕率（46% )高于晚卵裂胚 胎（18% )，早卵裂胚胎组的流产率（20% )低于晚卵裂胚胎的流产率（48% )。此外，牛的 早期卵裂胚胎发育到囊胚的几率明显高于晚期卵裂胚胎，并且囊胚细胞数较多，细胞凋亡 数较低的比例。研究表明，初次卵裂时间可以作为猪克隆胚胎发育潜能的重要标识，选择早 裂的胚胎进行移植，有助于提高克隆效率。山羊作为重要的家畜，不仅可以为市场提供丰富 的肉、毛、绒、皮和乳等畜产品，而且具有重要的科研价值。然而，关于山羊克隆胚胎卵裂时 间和发育潜能的研究较少，因此，本试验初步探索不同初次卵裂时间对后续山羊克隆胚胎 发育能力的影响。
[0004]尽管胚胎的初次卵裂时间是衡量胚胎质量和后续发育能力的重要指标之一，然而 具体的内在基因变化尚不清楚。研究发现早期卵裂胚胎多数来自于胞浆和核同步性较好的 优质卵母细胞，较好的代谢储备，使得它们能较早的有丝分裂。有研究认为，排出第一极体 时间较早的卵母细胞，孤雌激活后发育到囊胚的比例高，进一步说明初次卵裂时间不仅与 胚胎后期发育潜能有关而且与卵母细胞质量有很大关系。以上结论验证了初次卵裂是由积 累的母源胞质中的转录物来调控的观点。然而，在受精后胚胎基因组会发生激活，进而引发 了胚胎核内转录激活，胚胎后续的发育便开始依赖于新合成的mRNA和蛋白质。此外，在胚 胎重构的研究中发现，卵母细胞质量会影响重构胚的后续发育能力，优化卵母细胞体外成 熟的条件能够提高所构建的重构胚胎的质量。优化卵母细胞体外成熟的条件以及筛选检测 山羊克隆胚胎质量的相关基因的方法为现有技术亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种提高山羊卵母细胞的成熟率的方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种基于初次卵裂时间和囊胚基因表达水平筛选检 测山羊克隆胚胎质量的相关基因的方法。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008] -种提高山羊卵母细胞的成熟率的方法，处理卵巢组织并挑选卵母细胞，在体外 成熟培养液中进行体外成熟培养18~30h，所述的体外成熟培养液中添加有1~10 yg/mL 的促卵泡素FSH和1~10 yg/mL促黄体生成素LH。
[0009] 作为一种优选技术方案，所述体外成熟培养液中添加有10 y g/mL的FSH和10 y g/ mL LH〇
[0010] 所述的体外成熟培养液中还添加有1 yg/mL17 -E2。
[0011] 进一步优选的，所述体外成熟培养液的配方为：
[0012] 1 ~10 y g/mL FSH+1 ~10 y g/mL LH+1 y g/mL 17 0 -E2+10 % 胎牛血清的 TCM 199 ；
[0013]最优选为：10 y g/mL FSH+10 y g/mL LH+1 y g/mL 17 0 -E2+10 % 胎牛血清的 TCM199 ；
[0014] 进一步优选的，所述体外成熟培养的时间为24h。
[0015] 所述卵巢组织的处理方法为切剖法或抽吸法。
[0016] -种基于初次卵裂时间和囊胚基因表达水平筛选检测山羊克隆胚胎质量的相关 基因的方法，包括以下步骤：
[0017] (1)采用供体细胞和来源于山羊卵巢组织的卵母细胞构建重组胚并激活后卵裂、 发育至囊胚，并于第24h和48h检查卵裂率，收集0~24h和24~48h内卵裂的胚胎分别 作为早卵裂胚胎组和晚卵裂胚胎组继续培养；第7. 5d收集各组囊胚；所述的卵母细胞为采 用上述的方法进行体外成熟培养的卵母细胞；
[0018] (2)提取步骤⑴中所收集的两组囊胚的RNA并反转录合成cDNA ;
[0019] (3)以步骤⑵合成的cDNA为模板以下序列为引物进行荧光定量PCR扩增目的基 因GAPDH、PGC-1 a、NRF-1、BCL2和BAX :
[0020] 扩增GAPDH引物对：F:CGACTTCAACAGCGACACTCAC
[0021] R:CCCTGTTGCTGTAGCCGAATTC
[0022] 扩增 PGC-1 a 引物对：F: CACCCACAACTCCTCCTCAT
[0023] R:CCTTCCTTTCCTCGTGTC
[0024]扩增NRF-1引物对：F:AGGCTGGGGCAAAGAAAG
[0025] R:CCAACCTGGATAAGCGAGAC
[0026]扩增BCL2引物对：F:ATGTGTGTGGAGAGCGTCA
[0027] R:AGAGACAGCCAGGAGAAATC
[0028]扩增BAX引物对：F:GCATCCACCAAGAAGCTGAG
[0029]R:CCGCCACTCGGAAAAAGAC;
[0030](4)用SPSS 18. 0软件中的单因素方差分析两组实验结果的差异显著性，两组实 验结果中差异显著的目的基因即为评估山羊克隆胚胎质量的相关基因。
[0031] 步骤⑷所述的评估山羊克隆胚胎质量的相关基因为线粒体相关基因PGC-1 a和 NRF-l〇
[0032] 步骤⑵中提取所述RNA的过程为：将胚胎转移至收集管内，向管内加入裂解液， 并向裂解液中添加carrier RNA，涡旋后加入70%的酒精，充分混匀，将混合液转移到收集 管和柱子上，离心弃液体，再加入Buffer RW1，离心弃液体；加入DNase I工作液到柱子膜 上，静置10~20min，加入Buffer RW1，离心后丢弃液体和收集管，加入Buffer RPE，离心弃 液体；然后加入80 %酒精，离心弃液体和收集管后，把柱子放在新的收集管上，打开盖子全 速离心5min，将柱子放在新的收集管上，垂直加入RNase-free水到柱子膜上，全速离心获 取 RNA〇
[0033] 研究发现在胚胎重构中，卵母细胞质量会影响重构胚的后续发育能力，因此，本发 明首先通过比较卵母细胞不同采集方法、培养液成分及体外培养时间等，优化了卵母细胞 体外成熟的条件，然后进一步构建重构胚胎，探讨不同初次卵裂时间的山羊克隆胚胎发育 至囊胚的潜能及基因的表达水平变化情况，尝试从基因的角度探讨山羊克隆胚胎初次卵裂 时间与其发育潜能的关系，为提高山羊克隆的效率提供理论参考。
[0034] 转录组学主要是从mRNA水平研究基因的转录表达，而mRNA的表达水平能反应细 胞的表型和功能。在胚胎发育过程中，线粒体不仅为胚胎发育提供能量，还能调节胚胎生存 的微环境，表明线粒体对胚胎的发育有重要作用，本试验想进一步在胚胎水平上研究线粒 体相关基因与胚胎发育潜能是否存在相关性。
[0035] 综上所述，本试验结合胚胎的初次卵裂时间和卵裂时胚胎的状态，试图分析线粒 体相关基因PGC-1 a和NFR-1与胚胎发育潜能是否存在相关性，为寻找预测山羊转基因克 隆胚胎发育潜能的研究提供了参考，也有助于筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的 效率。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 本发明优化了卵母细胞体外成熟的条件，然后进一步构建重构胚胎，探讨不同初 次卵裂时间的山羊克隆胚胎发育至囊胚的潜能及基因的表达水平变化情况，尝试从基因的 角度探讨山羊克隆胚