一种提高MiDGAT1在啤酒酵母中的三酰甘油合成能力的多肽及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶 1 (MiDGATI)中的 Pleckstrin 同源性（Pleckstrin Homology，PH)结构域（domain)序列及 功能鉴定。
【背景技术】
[0002] 当今世界，随着人类对各种矿产资源，如煤、石油、天然气等利用的不断耗尽，人类 急于寻找新的能源来源，特别是可再生资源。生物柴油，特别是微藻生物柴油，是一种可再 生资源，是人类急于寻找和探索的新能源之一，也是近年科学家研究的热点之一。与传统的 生物柴油的原料相比，例如植物油脂和动物脂肪，微藻具有生长快、生物量丰富、含油量高 和不占用土地等非常多的优势。缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa Reisigl H4301)是一种淡 水单细胞微藻，隶属绿藻门（Chlorophyta)。该藻在氮饥饿胁迫下能大量积累花生四烯酸 (ArA)，且在细胞中是以三酰甘油（TAG)的形式储存在油滴中。因此，该藻是潜在的生产微 藻生物柴油藻种。
[0003] 微藻生物柴油主要来自于存储脂类，其中最重要的一类就是TAG。TAG是一类中性 脂质，代表了真核细胞中最重要的能量存储形式。在许多植物中，TAG常积聚在种子中，但 花瓣、花粉和果实也能存储TAG。TAG是人类消费的主要可再生资源，除了食用，它们也被用 来生产油漆、洗涤剂、润滑剂、生物燃料和尼龙等方面。
[0004] TAG的合成主要是通过各种酶沿着肯尼迪途径（Kennedy pathway)来完成的，这 些酶依次把酰基辅酶A的酰基链转移到甘油骨架的sn-l、sn-2和sn-3位置。酰基辅酶A : 二酰基甘油酰基转移酶（DGAT，EC 2. 3. 1. 20)是一种具有催化活性的跨膜蛋白，作用于TAG 生物合成的最后步骤。它以酰基辅酶A为底物，催化并使sn-l，2-二酰基甘油（DAG)的sn-3 位酰化，从而形成TAG。因此，DGAT被认为是TAG生物合成的关键酶，它有可能被用来增加 含油植物的含油量。目前，研究发现了 3种类型的DGAT，即DGATUDGAT2和DGAT3,且表明， DGAT1和DGAT2是负责TAG合成的，而DGAT3被证明是参与了角质的生物合成。在很多高等 植物中虽然已经证明了 DGAT1具有TAG的合成功能，但是对微藻DGAT1合成TAG的功能研 究还是比较少的，目前只在三角褐脂藻（Phaeodactylum tricornutum)中有报道，但有关藻 类DGAT1中PH结构域的功能研究还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽。
[0006] 本发明的再一的目的是，提供一种分离的核苷酸序列。
[0007] 本发明的另一的目的是，提供一种重组表达载体。
[0008] 本发明的第四个目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。
[0009] 本发明的第五个目的是，提供上述多肽、核苷酸序列、重组表达载体或宿主细胞的 用途。
[0010] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0011] -种多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：
[0012] a) SEQIDN0:26的第47-153位置所示的氨基酸序列；或
[0013] b)SEQIDN0:26所示的氨基酸序列。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0015] -种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列选自下列中的任一种：
[0016] a) SEQIDN0:14的第408-728位置所示的核苷酸序列；
[0017] b)SEQIDN0. 14所示的核苷酸序列；
[0018] c)SEQIDN0. 25所示的核苷酸序列。
[0019] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0020] -种重组表达载体，所述的重组表达载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病 毒所构建的重组表达载体。
[0021] 优选地，所述的质粒是pYES2质粒。
[0022] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0023] -种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：
[0024] a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；
[0025] b)用如上任一所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
[0026] 优选地，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿 主细胞的后代。
[0027] 更优选地，所述的宿主细胞是酵母细胞。
[0028] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
[0029] 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上任一所述的重组表达载体、或如上 任一所述的宿主细胞在生产三酰甘油中的用途。
[0030]本发明优点在于：
[0031] 本申请发明人克隆获得一种新的DGAT基因，命名为MiDGATl，其编码的蛋白与这 2 种藻(Auxenochlorella protothecoides， GenBank ID：KFM28983 ；Tetraselmis sp.，GenBank ID:JAC66181)的DGAT1氨基酸相似性均达40%。同时，新奇地发现MiDGATl编码 的蛋白含有一个PH结构域，该结构域由107个氨基酸残基构成，且与藻类Auxenochlorella protothecoides(GenBank ID :KFM28983)的PH结构域（由97个氨基酸残基构成）氨基酸 相似性为42%。据此，发明人在已报道的藻类DGAT研究中搜索，还没有发现关于藻类DGAT1 中PH结构域的功能性研究报道。进而，发明人探讨了该PH结构域序列在MiDGATl合成 TAG过程中的作用。通过将编码PH结构域的cDNA片段从MiDGATl基因中切除，将剩余部 分（命名为MiDGATl- A PH)和MiDGATl分别转入到TAG合成缺陷啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株H1246中表达，即进行基因功能互补实验，发现MiDGATl和MiDGATl- A PH 编码的蛋白都具有合成TAG的能力，但通过半定量薄层色谱方法发现MiDGATl酵母合成的 TAG含量要比MiDGATl- A PH酵母高得多，从而证明了 PH结构域序列能增强MiDGATl在酵母 中合成TAG的能力。据此可将含有该PH结构域的MiDGATl在油料等作物中表达以显著增 加三酰甘油的产量。
【附图说明】
[0032] 图1.缺刻缘绿藻MiDGATl基因结构示意图。灰色线是非翻译区，黑色线为内含子， 黑色框为外显子。
[0033]图2?酵母细胞的Bodipy染色图片。其中MiDGAT2A(ZL201210477507. 7)、 MiDGAT2B(ZL201310668330. 3)是本实验室已申请的2件发明专利涉及的DGAT，在此作为参 照。
[0034] 图3.酵母油脂的TLC图谱。从左道到右道依次为MiDGATl- A PH、TAG标准品（英 国Nu-Chek公司）、MiDGATl、MiDGAT2A、MiDGAT2B、野生型酵母Scy62、缺陷株H1246、携带 PYES2的缺陷株。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0036] 本发明的主要技术路线为：
[0037] (1)将缺刻缘绿藻接种于BG-11培养基的三角锥形瓶中，置于温度为25°C、光照强 度为115 ymol photons ? m 2 ? s \光照周期为光照：黑暗/12h: 12h的培养箱中培养，每天 定期摇晃数次。收集藻体细胞，并提取基因组总RNA和DNA。
[0038] (2)基于缺刻缘绿藻转录组库，通过同源性搜索和基因注释，得到了 2条分别长 378bp (编号为 fu-G624HK004JT9FD)和 226bp (编号为 fu-G624HK004J09X9)的短片段。用 PCR扩增这2条片段，并将产物序列进行拼接，得到了 一条长641bp的cDNA片段。基于该 片段序列，我们利用cDNA末端快速扩增（RACE)技术克隆到该基因的全长cDNA序列，命名 为MiDGATl。然后，利用缺刻缘绿藻总RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增以验证 MiDGATl的cDNA全长序列。在此基础上，同时利用缺刻缘绿藻DNA作为模板进行PCR扩增， 得到MiDGATl的DNA全长序列。
[0039] (3)首先将PH结构域序列从MiDGATl基因中切除，剩余部分的片段命名为 MiDGATl-APH。然后根据MiDGATl和MiDGATl-APH的cDNA序列设计特