用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子的制作方法

用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子的制作方法
【专利说明】用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子
[0001] 本申请是申请日为2010年8月11日、发明名称为"用于增强植物中组成型基因表 达的调节性核酸分子"的中国专利申请201080038708. 6 (国际申请号PCT/EP2010/061659) 的分案申请。
[0002] 发明描述
[0003] 本发明属于植物分子生物学领域并且提供了用于产生高表达的组成型启动子和 产生具有增强的核酸组成型表达的植物的方法，其中将增强核酸表达的核酸（NEENAs)与 所述启动子功能性连接和/或导入植物中。
[0004] 转基因在植物中的表达强烈地受多种外部和内部因素影响，从而导致变动和不可 预测水平的转基因表达。经常不得不产生大量的转化体并进行分析，以鉴定具有合乎需要 的表达强度的株系。由于转化并筛选表达强度合乎需要的株系是昂贵和耗费人力的，故需 要一个或多个转基因在植物中高表达。当不得不在转基因植物中协调表达几个基因以实现 特定效应时，鉴于必须鉴定其中每个基因均强烈表达的植物，这个问题尤其严重。
[0005] 例如，取决于构建体设计和各个转化事件中T-DNA插入基因座的位置效应，转基 因的表达可以显著地变动。强启动子可以部分地克服这些难题。然而，显示强烈表达同时 特异性合乎需要的合适启动子的可获得性经常是有限的。为了确保可获得具有合乎需要的 表达特异性的充足启动子，额外启动子的鉴定和表征可能有助于弥合这种缺口。然而，具有 相应特异性和强度的启动子的天然可获得性和费时的候选启动子表征阻碍了合适的新启 动子的鉴定。
[0006] 为了克服这些难题，已经显示多样的遗传元件和/或基序积极地影响基因表达。 在它们当中，已经认可一些内含子作为具有改善基因表达的强大潜能的遗传元件。虽然机 制大多未知，但是已经显示一些内含子积极地影响成熟mRNA的稳态量，这可能通过增强转 录活性、改善mRNA成熟、增强胞核mRNA输出和/或改善翻译起始来影响（例如Huang和 Gorman, 1990;LeHir等人，2003 ;Nott等人，2004)。由于显示仅所选的内含子增加表达，故 剪接本身很可能解释不了观察到的效果。
[0007] 将内含子与启动子功能性连接时观察到的基因表达增加称作内含子介导的基因 表达增强（ME)并且已经在多种单子叶植物（例如Callis等人，1987 ;Vasil等人，1989 ; Bruce等人，1990 ;Lu等人，2008)和双子叶植物（例如Chung等人，2006 ;Kim等人，2006 ; Rose等人，2008)得到显示。在这个方面，显示内含子相对于翻译起始位点（ATG)的位置对 于内含子介导的基因表达增强至关重要（Rose等人，2004)。
[0008] 继一些内含子增强基因表达的潜能之后，显示这些内含子还在植物中于其原有核 苷酸环境下影响组织特异性。发现报道基因表达依赖于含有多达2个内含子的基因组区域 的存在（Sieburth等人，1997 ;Wang等人，2004)。也已经报道5'UTR内含子对启动子元件的 恰当功能性是重要的，这可能归因于内含子中存在的组织特异性基因控制元件（Fu等人， 1995a;Fu等人，1995b;Vitale等人，2003 ;Kim等人，2006)。然而，这些研究还显示内含子 与异源启动子的组合可能对基因表达的强度和/或特异性产生强烈的不利影响（Vitale等 人，2003;Kim等人，2006、W02006/003186、W02007/098042)。例如，花椰菜花叶病毒CaMV35S 组成型强启动子因与芝麻SeFAD25'UTR内含子组合而不利地影响表达（Kim等人，2006)。 与这些观察结果相反，一些文献显示通过ME增强核酸的表达而不影响相应启动子的组织 特异性（SchUnmann等人，2004)。
[0009] 在本申请中，描述了与组成型启动子功能性连接时增强所述启动子的表达同时不 影响其特异性的其他核酸分子。在本申请中将这些核酸分子描述为"增强核酸表达的核 酸"(NEENA)。内含子具有从分别的前mRNA剪接下来的内在特征。与其相反，本申请中即将 陈述的核酸不必要一定包含于mRNA中，或如果存在于mRNA中，没有必要一定从mRNA中剪 接下来，以增强源自与NEENA功能性连接的启动子的表达。
[0010] 发明详述
[0011] 本发明的第一实施方案包括用于产生高表达的组成型启动子的方法，所述高表达 的组成型启动子包含与启动子功能性连接的一个或多个增强核酸表达的核酸（NEENA)分 子，所述方法包括
[0012] i)具有如SEQIDNO: 1至19、优选地SEQIDNO: 1至9的任一者中所定义序列的 核酸分子，或
[0013]ii)具有下述序列的核酸分子，所述序列与如SEQIDNO: 1至19、优选地SEQID NO: 1至9所定义的任一序列具有80%或更大的同一性，优选地，该同一性是85%或更大， 更优选地，该同一性是90%或更大，甚至更优选地，该同一性是95%或更大、96%或更大、 97 %或更大、98 %或更大或99 %或更大，在最优选的实施方案中，该同一性相对于如SEQID N0:1至19、优选地SEQIDN0:1至9所定义的任一序列是100%，或
[0014]iii)i)或ii)的核酸分子的100个或更多连续碱基、优选地150个或更多连续碱 基、更优选地200个或更多连续碱基、或甚至更优选地250个或更多连续碱基的片段，所述 片段具有如具备SEQIDNO: 1至19、优选地SEQIDNO: 1至9所定义任一序列的相应核酸 分子那样的增强表达活性，例如65%或更大、优选地70%或更大、更优选地75%或更大，甚 至更优选地80 %或更大、85 %或更大或90 %或更大，在一个最优选的实施方案中，95 %或 更大的增强表达活性，或
[0015]iv)作为前文在i)至iii)下提及的核酸分子中任一者的互补物或反向互补物的 核酸分子，或
[0016]v)使用由SEQID N0:20 至 57、优选地如表 2 中所示SEQID N0:20/21;26/27; 30/31 ;38/39 ;42/43 ;44/45 ;46/47 ;50 ;51和56/57描述的寡核苷酸引物，通过PCR可获得 的核酸分子，或
[0017]vi) 100个或更多核苷酸、150个或更多核苷酸、200个或更多核苷酸或250个或更 多核苷酸的核酸分子，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸钠（SDS)、0. 5M NaP04、lmMEDTA杂交，以及在50°C或65°C、优选地65°C于2XSSC、0. 1%SDS中洗涤的条件 下与包含由SEQIDNO: 1至19、优选地SEQIDNO: 1至9描述的增强转录的核苷酸序列或其 互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地 至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。优选地，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二 烷基硫酸钠（SDS)、0. 5MNaP04、lmMEDTA杂交，以及在50°C或65°C、优选地65°C于1XSSC、 0.1 %SDS中洗涤的条件下与包含由SEQIDNO: 1至19、优选地SEQIDNO: 1至9描述的增 强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更 优选地至少200、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交；更优选地，所述核酸分 子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸钠（SDS)、0. 5MNaP04、lmMEDTA杂交，以及在50°C 或65°C、优选地65°C于0. 1XSSC、0. 1%SDS中洗涤的条件下与包含由SEQIDNO:l至19、 优选地SEQIDNO:l至9描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至 少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸 分子杂交。
[0018] 在一个实施方案中，一个或多个NEENA相对于与NEENA功能性连接的启动子是异 源的。
[0019] 如以上在v)下所述，使用如表2中所示由SEQIDN0:20至57、优选地SEQID NO:20/21 ;26/27 ;30/31 ;38/39 ;42/43 ;44/45 ;46/47 ;50/51 和 56/57 所定义的寡核苷酸， 通过PCR可获得的核酸分子是例如使用如下文实施例1中所述的条件，从来自拟南芥属 (Arabidopsis)植物如拟南芥（A.thaliana)的基因组DNA中可获得的。
[0020] 技术人员知晓变动温度特征、循环数和/或缓冲液组成或浓度以获得相应的 NEENA分子。表2中描述在用于获得相应NEENA分子的相应PCR反应中待使用的寡核苷酸 的特定组合。
[0021 ] 本领域技术人员知晓用于使单向启动子变成双向启动子的方法和使用启动子序 列的互补物或反向互补物以产生与原始序列具有相同启动子特异性的启动子的方法。用 于组成型及诱导型启动子的此类方法例如由Xie等人（2001)"Bidirectionalizationof polarpromotersinplants(植物中极性启动子的双向化）"naturebiotechnology19 第677 - 679页描述。作者描述了添加最小启动子至任意给定启动子的5'引发端足以在 两个方向获得启动子控制表达，同时具有相同的启动子特异性。因而，与如上文所述NEENA 功能性连接的高表达启动子在互补或反向互补情况下是有功能的，并且因此所述NEENA在 互补或反向互补情况下也是有功能的。
[0022] 如本文中所用的组成型启动子意指在基本上全部植物组织中贯穿植物或其部分 的基本上整个生活期限表达的启动子。在基本上全部植物组织中表达的启动子也可以包括 在主要植物组织如叶、茎和/或根的至少两者中并且可以在或可以不在一些或全部次要组 织或细胞如表皮、气孔、毛状体、花、种子或分生组织中表达的启动子。在一个优选的实施方 案中，如本文中所意指的组成型启动子至少在绿色组织如叶和茎中表达。
[0023] 贯穿植物或其部分的基本上整个生活期限表达的启动子也可以包括在嫩的和已 发育的组织中表达，但是可以在植物生活期限中的特定时间点或在特定条件下如在萌发和 /或衰老期间或在生物性和/或非生物性胁迫条件如真菌性或细菌性感染、干旱、热或寒冷 下缺少表达的启动子。在一个优选的实施方案中，贯穿植物的基本上整个生活期限表达的 组成型启动子至少在充分扩大的组织中表达直至开始衰老。
[0024] 原则上，NEENA可以与任意的启动子如组织特异性、诱导型、发育特异性或组成型 启动子功能性连接。相应的NEENA将导致在与至少一种NEENA功能性连接的相应启动子控 制下的异源核酸的增强表达。增强除组成型启动子之外的启动子例如组织特异性启动子的 表达将给予这些启动子的特异性。核酸在相应启动子控制下的表达将是在无NEENA的情况 下检测不到所述核酸的转录物的额外组织或发育阶段中可检测的。因此，组织特异性或发 育特异性或任意其他启动子可以通过将至少一种如上文所述的NEENA分子与所述启动子 功能性连接而变成组成型启动子。因此，本发明的另一个实施方案是提供用于将植物中有 功能的任意给定启动子的特异性通过相应启动子与NEENA分子连接而赋予组成型启动子 的方法，其中所述NEENA分子包含如以上在i)至vi)下所述的序列。
[0025] 优选地，一个或多个NEENA与任意的组成型启动子功能性连接并且将增强在所述 启动子控制下的核酸分子的表达。待用于本发明任意方法中的组成型启动子可以源自植 物例如单子叶或双子叶植物、源自细菌和/或病毒或可以是合成性启动子。待使用的组成 型启动子例如是来自欧芹（P.crispum)的PcUbi-启动子（W0 2003102198)、来自玉米的 ZmUbi-启动子、来自编码腈水解酶1的拟南芥基因At3g44310的AtNit-启动子、来自玄参 (figwort)花叶病毒的34S-启动子、来自烟草花叶病毒的35S-启动子、源自农杆菌的nos 启动子和ocs启动子、ScBV-启动子（US5994123)、SUPER-启动子（Lee等人2007,Plant. Phys.)、来自编码铁氧还蛋白NADH还原酶的拟南芥基因At5g66190的AtFNR-启动子、来自 豌豆（Pisumsativum)的ptxA启动子（W02005085450)、来自编码磷酸三糖易位蛋白的拟 南芥基因At5g46110的AtTPT-启动子、来自拟南芥基因At4gl4880和At4gl4890的双向 AtOASTL-启动子、来自编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的拟南芥基因的Atlgl3440的PR00194 启动子、来自编码二磷酸果糖醛缩酶的拟南芥基因At3g52930的PR00162启动子、AHAS-启 动子（W02008124495)或咖啡酰辅酶A-MT启动子和来自稻的0sCP12(W02006084868)。
[0026] 与NEENA功能性连接的本发明高表达的组成型启动子可以用于任意植物中，所述 植物包括例如苔藓、蕨类、裸子植物或被子植物，例如单子叶或双子叶植物。在一个优选的 实施方案中，与NEENA功能性连接的本发明所述启动子可以用于单子叶或双子叶植物中， 优选地是作物植物如谷物、大豆、卡诺拉油菜、棉属植物、马铃薯、甜菜、稻、小麦、高粱、大 麦、芭蕉属植物、甘蔗、芒属植物等。在本发明的一个优选的实施方案中，与NEENA功能性连 接的所述启动子可以用于单子叶作物植物如谷物、稻、小麦、高粱、芭蕉属植物、芒属植物、 甘蔗或大麦中。在一个特别优选的实施方案中，与NEENA功能性连接的启动子可以用于双 子叶作物植物如大豆、卡诺拉油菜、棉属植物、甜菜或马铃薯中。
[0027] 如本申请中所用的高表达的组成型启动子意指例如与NEENA功能性连接的启动 子，所述NEENA引起该启动子在植物或其部分中增强的组成型表达，其中源自功能性连接 于NEENA的相应启动子控制下的核酸分子的RNA积累或RNA合成速率比由缺少本发明 NEENA的相同启动子引起的表达高，优选地显著更高。优选地，与相同条件下培育的包含不 与本发明NEENA功能性连接的相同组成型启动子的同龄对照植物相比，植物中相应核酸的 1^的量和/或1^合成速率和/或1^稳定性增加50%或更大，例如100%或更大、优选 地200%或更大、更优选地5倍或更大、甚至更优选地10倍或更大、最优选地20倍或更大， 例如50倍。
[0028] 在本文中使用时，显著更高指技术人员知晓如何确定的统计显著性，例如通过对 相应的数据集合应用统计检验如t-检验。
[0029] 用于检测由启动子赋予的表达的方法是本领域已经的。例如，该启动子可以与标 记基因如GUS、GFP或萤光素酶基因功能性连接，并且可以在植物或其部分中测定由相应标 记基因编码的相应蛋白质的活性。作为代表性实例，下文详细描述用于检测萤光素酶的方 法。其他方法例如是通过本领域已知的方法，例如RNA印迹分析法、qPCR、连缀（run-on)测 定法或本领域所述的其他方法测量受该启动子控制的核酸分子的RNA稳态水平或合成速 率。
[0030] 技术人员知晓多种用于功能性连接两个或多个核酸分子的方法。此类方法可以包 括限制性切割/连接法、不依赖连接酶的克隆法、重组工程法、重组或合成法。其他方法可 以用来功能性连接两个或多个核酸分子。
[0031] 本发明的又一个实施方案是用于产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分与 相应的对照植物或其部分相比具有一种或多种核酸分子的增强的组成型表达，所述方法包 括步骤：将包含如上文在i)至vi)下所定义核酸分子的一个或多个NEENA导入所述植物或 其部分，和将所述一个或多个NEENA与启动子、优选地组成型启动子并且与处在所述启动 子、优选地组成型启动子控制下的核酸分子功能性连接，其中NEENA对所述核酸分子为异 源。
[0032]NEENA可以相对于处在与NEENA功能性连接的所述启动子的控制下的核酸分子为 异源，或它可以相对于该启动子和处在该启动子控制下的核酸分子均为异源。
[0033] 就核酸分子或DNA而言，术语"异源的"指这样的核酸分子，所述核酸分子有效连 接于，或受到操作以变得有效连接于自然界中不与该核酸分子有效连接或自然界中与该核 酸分子在不同位置有效连接的第二种核酸分子。例如，本发明的NEENA在其天然环境中与 其天然启动子功能性连接，而在本发明中，它与可以源自相同生物、不同生物或合成性启动 子如SUPER-启动子的另一个启动子连接。它也可以意指本发明的NEENA与其天然启动子 连接，但是处于所述启动子控制下的核酸分子相对于包含其天然NEENA的启动子为异源。 此外，应当理解，启动子和/或处在与本发明NEENA功能性连接的所述启动子控制下的核酸 分子相对于所述NEENA为异源，原因是它们的序列已经受到例如突变如插入、缺失等操作， 从而启动子和/或处在所述启动子控制下的核酸分子的天然序列被修饰并且因此已经变 得相对于本发明的NEENA为异源。也可以理解，当NEENA与其天然启动子功能性连接，其 中NEENA的位置相对于所述启动子改变，从而该启动子在这种操作后显示更高表达时，该 NEENA相对于功能性连接至NEENA的核酸为异源。
[0034] 如本文中所意指的显示增强的核酸分子组成型表达的植物意指与相同条件下培 育的没有与相应核酸分子功能性连接的相应NEENA的对照植物相比，具有更高的、优选地 统计显著更高的核酸分子组成型表达的植物。这种对照植物可以是野生型植物或是包含控 制与本发明植物中相同的基因的相同启动子的转基因植物，其中所述启动子不与本发明的 NEENA连接。
[0035] 产生如本文中所用的植物包括用于稳定转化的方法，如借助农杆菌介导的转化、 原生质体转化、粒子轰击等将重组DNA构建体导入植物或其部分并且任选地随后再生出转 基因植物。它还包括用于瞬时转化植物或其部分的方法，如病毒感染法或农杆菌浸润法。技 术人员知晓用于稳定和/或瞬时转化植物或其部分的其他方法。方法如育种方法或原生质 体融合法可以用于本发明植物的产生并且由本发明涵盖。
[0036] 本发明的方法可以应用于任意植物，例如裸子植物或被子植物，优选地是被子植 物，例如双子叶或单子叶植物，优选地是双子叶植物。优选的单子叶植物例如是谷物、小麦、 稻、大麦、高粱、色蕉属植物、甘鹿、芒属植物和短柄草属植物（Brachypodium)，特别优选的 单子叶植物是谷物、小麦和稻。优选的双子叶植物是例如大豆、油菜籽、卡诺拉油菜、亚麻、 棉属植物、马铃薯、甜菜、万寿菊和拟南芥属植物（Arabidopsis)，特别优选的双子叶植物是 大豆、油菜籽、卡诺拉油菜和马铃薯。
[0037] 在本发明的一个实施方案中，如上文定义的方法包括以下步骤：
[0038] a)将包含如上文的i)至vi)中所定义核酸分子的一个或多个NEENA导入植物或 其部分，和
[0039] b)将所述一个或多个NEENA整合至所述植物或其部分的基因组中，从而所述一个 或多个NEENA与相对所述一个或多个NEENA为异源的优选地组成型表达的内源核酸功能性 连接，和任选地
[0040] c)从所述转化的细胞再生出包含所述一个或多个NEENA的植物或其部分。
[0041] NEENA可以相对于处在与NEENA功能性连接的所述启动子的控制下的核酸分子为 异源，或它可以相对于该启动子和处在该启动子控制下的核酸分子均为异源。
[0042] 可以将一个或多个NEENA分子借助粒子轰击法、原生质体电穿孔法、病毒感染法、 农杆菌介导的转化法或本领域已知的任意其他方法导入植物或其部分。可以将NEENA分子 导入整合例如至质粒或病毒DNA或病毒RNA中。NEENA分子也可以在导入植物或植物部分 中之前包含于BAC、YAC或人工染色体上。也可以将NEENA分子作为包含NEENA序列的线性 核酸分子导入，其中额外的序列可以紧邻该核酸分子上的NEENA序列存在。毗邻NEENA序 列的这些序列可以长约20bp，例如20bp至数百碱基对，例如100bp或更多，并且可以促进整 合至基因组中，例如通过同源重组。可以使用用于基因组整合的任何其他方法，无论它是定 向整合法，如同源重组，或随机整合法，如非常规（illegitimate)重组。
[0043] 可以与NEENA分子功能性连接的优选地组成型表达的内源核酸可以是任意核酸， 优选地是任意的组成型表达的核酸