一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因开 放阅读框的体外重组表达技术，活性重组蛋白的分离纯化，重组蛋白对金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌、大肠杆菌的杀菌抑菌作用的研究。同时，还涉及到该重组蛋白作为一种新型抗 菌药物、饲料添加剂以及免疫增强剂在生产中的应用价值。
【背景技术】
[0002] 1996年Yoshida等从家蚕纯化出了一个分子量为19kDa的蛋白质，该蛋白能够 结合G+细菌和肽聚糖（PGN)并能够激活过氧化物酶级联反应，将其命名为肽聚糖识别蛋白 (PGRPs)。之后，在鱼类、鼠和人中均已克隆得到PGRP分子，表明PGRP是一类进化保守的蛋 白质家族。PGRP作为一种PRR分子，在机体抵御细菌类病原体中发挥着重要的作用。
[0003] 通过对果蝇基因组进行分析显示，在果蝇中有13个PGRP基因至少编码17个PGRP 蛋白。根据PGRP氨基酸长度的不同，PGRP可以分为长型（PGRP-L)和短型（PGRP-S)两种。 果蝇中有7种PGRP-S和10种PGRP-L。非洲按蚊有7种PGRP基因，其中有3个PGRP基因 编码3种PGRP-S，4个PGRP基因编码7个PGRP-L。在斑马鱼中目前报道了 6种PGRP，包括 PGRP-SC2，-SC1a，-L，PGRP-2A，-2B和PGRP-6。目前，在哺乳类中只发现了 4种PGRP蛋白，分 别是PGLYRP-1、-2、-3 和-4,其中PGLYRP-1 为短型PGRP，PGLYRP-2 为长型PGRP，PGLYRP-3 和-4长度介于短型和长型之间，为中间型PGRP。
[0004] 尽管非脊椎动物和脊椎动物的PGRP在结构上较为相似，但是且具有不同的功能。 昆虫中的PGRP具有细胞激活、吞噬和水解PGN的功能。具有细胞激活作用的PGRP(如果蝇 的PGRP-SA、PGRP-SD和PGRP-SC1)通过激活Toll或Imd信号通路诱导抗菌肽表达而发挥 抗菌作用。有些PGRP如蚕的PGRP-S则通过激活酚过氧化酶原级联反应诱导抗菌肽表达。 其他的PGRP如果蝇的PGRP-SC1、PGRP-LB、和PGRP-SB1具有N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰 胺酶活性，能够能水解细菌中N-乙酰胞壁酸与L-丙氨酸之间的酰胺键，将活性肽聚糖分子 转变为没有活性的肽聚糖片断，而将肽聚糖清除。昆虫中只有PGRP-SB1同时具有酰胺酶和 杀菌作用，但是只对一种细菌teri?具有杀菌作用，而该功能有可能是依赖 其酰胺酶活性产生的。哺乳类中的PGRP具有酰胺酶和杀菌活性，其中PGLYRP-2具有酰胺 酶活性；另外的PGLYRP-1，-2,和-3具有抗菌活性，能够对多种G+和G具有杀菌作用。相 对于昆虫的PGRP，哺乳类中的PGRP广谱杀菌作用并不依赖其酰胺酶活性。
[0005] 同高等脊椎动物一样，鱼类也是通过免疫系统来抵御外来病原生物的侵害，通过 固有免疫反应和适应性免疫反应来维持机体的正常功能及自身内环境的稳定。研究显示， 鱼类是最早具有适应性免疫的低等脊椎动物。但，相对适应性免疫系统而言，鱼类的固有免 疫系统更为完善，在防御外界病原入侵的过程中，发挥着更为关键的作用。由于鱼类特殊的 进化地位以及一些重要的生物学特性，已成为研究免疫系统进化的重要模式生物。目前，借 鉴人体免疫学预防各种疾病的成功经验，采用科学而环保的免疫学方法来防治鱼类疾病， 已成为鱼病学研究者的共识。
[0006] 相对于昆虫和哺乳类而言，鱼类PGRP的研究起步相对较晚。但是，研究显示，鱼类 中的PGRP功能较为特殊，同时具有酰胺酶和杀菌功能。本发明中的半滑舌鳎PGRP为长型 肽聚糖识别蛋白，其重组蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌均具有较强的抗菌功能。 PGRPs在鱼类中的研究，将为进一步揭示固有免疫系统的分子进化及作用途径，广谱抗菌药 物和免疫增强剂的筛选提供指导。
[0007] 半滑舌鳎，为近海名贵的大中型经济鱼类，我国主要集中于渤海、黄海海域。因其 肉嫩味美、营养丰富，深受人们的喜爱。迄今，人们对半滑舌鳎的免疫学方面的研究相对较 少。
【发明内容】
[0008] 发明目的：本发明对半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白（Cs-PGRP)基因编码区进行原核重 组，对其蛋白功能进行研究，深入探讨Cs-PGRP的杀菌抑菌活性，为抗菌药物和免疫增强剂 的筛选提供指导。
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋 白的DNA序列，其喊基序列如SEQ IDN0:4所不。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码 蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0:1所示。
[0011] 本发明的又一个目的是提供半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的 DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0012] 本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌。
[0013] 本发明的又一个目的是提供所述的DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞 系统或转基因重组菌在生产半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白中的应用。
[0014] 本发明的又一个目的是提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋 白的制备方法。
[0015] 本发明的又一目的是提供一种所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP在制备 广谱抗菌类药物、免疫增强剂、保健品、饲料添加剂方面的应用。
[0016] 技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种半滑舌鳎肽聚糖识 别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDN0 :4所示。
[0017] -种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0018] 含有所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列的重组表 达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0019] 所述的重组表达载体，将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达 半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的重组表达载体。
[0020] 所述大肠杆菌表达载体为pET-32a。
[0021] 一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选 得到转基因重组菌。
[0022] 所述的DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产 半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白中的应用。
[0023] -种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的制备方法，包括以下步 骤： 1)利用带有限制性内切酶位点的引物CsExPGRP-F和CsExPGRP-R扩增半滑舌鳎Cs-PGRP基因开放阅读框片段得到PCR扩增产物；其碱基序列如SEQIDN0 :4所示。
[0024] 2)将PCR扩增产物和pET32a经Kpnl和Hindlll双酶切，连接后转化表达菌株 BL21 (DE3)得到重组子； 3)将重组子进行IPTG诱导表达，超声波破碎收集菌体得到重组蛋白，经纯化、复性后 得到具有抗菌活性的肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP。
[0025] -种所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP在制备广谱抗菌类药物、免疫增强 剂、保健品、饲料添加剂方面的应用。
[0026] 有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点： (1)Cs-PGRP蛋白对革兰氏阳性细菌的抑菌杀菌效果： 低浓度的Cs-PGRP蛋白对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，高浓度则具有杀菌作用。当 在培养基中加入60yg/mL的重组蛋白时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长明显受到 了抑制；当向培养基中加入90yg/mL的重组蛋白时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌几乎 无法生长，8小时抑菌率为80. 9%和77. 9%。
[0027] (2) Cs-PGRP蛋白对革兰氏阴性细菌的抑菌杀菌效果 当在培养基中加入60yg/mL的重组蛋白时，大肠杆菌的生长同样受到了抑制；当向 培养基中加入90yg/mL的重组蛋白时，大肠杆菌的生长受到了明显抑制，8小时抑菌率为 74. 8%。
【附图说明】
[0028] 图1半滑舌鳎PGRP-L基因用于原核表达片段的电泳结果；泳道1:csPGRP-L扩展 片段；M:DNA分子量标准（DL2000); 图2IPTG诱导pE