共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因 重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳房炎又被称为奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到外界刺激或致病菌感染时所发 生的一种炎症反应。其不仅会引起奶牛产乳量的下降，缩短奶牛的更替周期，严重时甚至会 造成患病奶牛泌乳能力的完全丧失。因此，奶牛乳房炎的临床防治却是一直困扰奶牛养殖 业的一大难题。目前该病的防治主要通过提过规范化养殖管理及使用抗生素和化疗药物， 但由于不同地区致病菌的差异以及抗生素等的长期不规范使用，在治疗过程中产生的细菌 耐药性等问题常常给地区性奶牛乳房炎的治疗带来困难。因此，临床上亟需一种新的研究 策略来防治奶牛乳房炎，应对以上问题。
[0003] 目前，随着基因疗法的日益兴起，使用基因药物代替常规抗生素预防和治疗奶牛 乳房炎，已成为应对抗生素滥用导致的细菌耐药性增强等一系列问题的研究重点和热点。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种共表达SAL-2和hLYZ双抑菌基因重组 腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。将SAL-2对金黄色葡萄球菌的广谱抑菌效果、 hLYZ广泛高效抑菌且不会损伤哺乳动物细胞的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源 基因的优势结合起来，构建出可以共表达上述基因的重组腺病毒，最终检验在腺病毒介导 下SAL-2和hLYZ对奶牛乳房炎主要致病菌的联合抑菌作用。为进一步利用重组腺病毒在 体内外抑制奶牛乳房炎致病菌的生长及研制奶牛乳房炎治疗和预防疫苗奠定实验基础。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种共表达SAL-2和hLYZ双 抑菌基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0006] 1)从金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出SAL-2 基因序列GI:NC_009875 和hLYZ基因序列GI:NM_000239 ;
[0007] 所述的SAL-2基因和hLYZ基因的扩增包括：以SAL-FSEQIDNO: 1和SAL-RSEQ IDN0 :2为引物，以金黄色葡萄球菌噬菌体基因组DNA为模版，扩增SAL-2基因序列；以 LYZ-FSEQIDN0:3和LYZ-RSEQIDN0:4为引物，以人乳体细胞总RNA为模版，扩增hLYZ 基因序列；以rSAL-FSEQIDN0:5和rSAL-RSEQIDN0:6为引物，以金黄色葡萄球菌噬 菌体基因组DNA为模版，扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL-2基因序列；
[0008] 2)将获得的目的基因分别克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重 组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183 内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ;
[0009] 3)将重组腺病毒质粒由PacI酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得 重组腺病毒Ad-SAL-LYZ。
[0010] 所述的构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。
[0011] 所述的构建共表达SAL-2和hLYZ基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在防 治乳房炎小鼠模型中细菌性疾病生物制品方面的应用。
[0012] 本发明的有益效果是：SAL-2对金黄色葡萄球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛抑菌 且不会损伤动物细胞的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构 建出可以共表达上述基因的重组腺病毒，检验在腺病毒介导下SAL-2和hLYZ基因对奶牛 乳房炎小鼠模型主要致病菌的联合抑菌作用。通过检测重组腺病毒在J1EK293细胞中表达 蛋白对大肠杆菌（K88)、金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌（ATCC12228)、 停乳链球菌（ATCC9809)和无乳链球菌等多株乳房炎致病菌的抑菌活性和最小抑菌浓度 (MIC)，综合评价了重组腺病毒对奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的抑菌作用，研究结果显 示重组腺病毒在体外表达的目的蛋白可以有效抑制除K88之外的其他菌株，且葡萄球菌最 为敏感。本发明最终研制出一种针对乳房炎动物模型细菌性疾病的广谱疫苗。
【附图说明】
[0013] 图1是SAL-2和hLYZ基因PCR/RT-PCR扩增结果（M:DL250bpDNA分子质量标准； 1 :SAL-2基因PCR扩增产物；2 :hLYZ基因RT-PCR扩增产物）。
[0014] 图2是腺病毒穿梭载体的PCR扩增结果（M:DL250bpDNAMarker;1 :SAL-2基因 PCR扩增产物；2 :hLYZ基因PCR扩增产物；3 :SAL-LYZPCR扩增产物）。
[0015] 图3是腺病毒穿梭载体双酶切鉴定结果（M:DLlkbDNAMarker;1 :pShuttle-LYZ 经SeaI和XhoI的双酶切产物；2 :pShuttle_SAL经SeaI和XhoI的双酶切产物；3: pShuttle-SAL-LYZ经BglII和XhoI的双酶切产物；4:pShuttle-SAL-LYZ经SeaI和Xho I的双酶切产物；5 :pShuttle-SAL-LYZ经BglII和NotI的双酶切产物）。
[0016] 图4是重组腺病毒质粒的电泳结果（M:DL1KbDNAMarker;1:重组腺病毒质粒 pAd-SAL;2:重组腺病毒质粒pAd-LYZ;3:重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ;4:重组腺病毒质 粒pAd-GFP)〇
[0017] 图5是重组腺病毒质粒的PacI酶切鉴定结果（M:DL1KbDNAMarker;1:重组腺 病毒质粒pAd-SAL的PacI酶切产物；2:重组腺病毒质粒pAd-LYZ的PacI酶切产物；3: 重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ的PacI酶切产物；4:重组腺病毒质粒pAd-GFP的PacI酶 切产物）。
[0018] 图6是重组腺病毒质粒转染HEK293细胞产生CPE图（10X)(A:正常HEK293细胞 图；B:重组腺病毒质粒pAd-SAL转染HEK293细胞CPE图；C:重组腺病毒质粒pAd-LYZ转染 HEK293细胞CPE图；D:重组腺病毒质粒pAd-SAL-LYZ转染HEK293细胞CPE图；E:重组腺病 毒质粒pAd-GFP转染HEK293细胞CPE图）。
[0019] 图7是重组腺病毒感染HEK293细胞荧光检测图（20X)(A:重组腺病毒Ad-SAL感 染HEK293细胞后24h荧光图；B:重组腺病毒Ad-LYZ感染HEK293细胞后24h荧光图；C:重 组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染HEK293细胞后24h荧光图；D:重组腺病毒Ad-GFP感染HEK293 细胞后24h荧光图）。
[0020] 图8是重组腺病毒感染HEK293细胞后经RT-PCR检测目的基因的结果图（M:DL 250bpDNAMarker; 1 :重组腺病毒Ad-LYZ感染后RT-PCR检测hLYZ基因；2 :重组腺病 毒Ad-SAL感染后RT-PCR检测SAL-2基因；3 :重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR检 测SAL-2基因；4 :重组腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR检测hLYZ基因；5 :重组腺病毒 Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR检测SAL-LYZ基因）。
[0021] 图9是Westernblotting检测重组腺病毒感染HEK293细胞后各目的蛋白的表达 情况。
[0022] 图10是BCA定量方法测定重组腺病毒感染HEK293细胞后蛋白提取物浓度所绘制 的标准曲线。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0024] 随着分子生物学、免疫学、病理学及相关学科的发展，基因治疗现已成为疾病防治 研究的热点。目前，腺病毒（adenovirus，Ad)载体疗法是基因治疗中最有前景的基因转移 方法之一，它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中，载体的构建和操作简单，宿 主范围广，感染性强，可经不同途径进入不同组织，还能感染分化后的非分裂期细胞。
[0025] 大量研究结果表明，内溶素（virolysin)是噬菌体感染宿主菌后实现裂解功能的 主要成分，其通过在感染后期水解宿主菌细胞壁成分间的连接键而达到裂解细菌的目的， 对无细胞壁机构的机体细胞无损伤作用。内溶素对细菌存活所必须的细胞壁糖基有着较高 的亲和力，在快速高效杀灭细菌的同时，细菌很难对内溶素产生抗性，因此，内溶素应用于 细菌性疾病的防治拥有快速、高效、安全且不易产生耐药性等优点。SAL-2是由短尾病毒科 的金黄色葡萄球菌噬菌体SAP-2的第14个开放阅读框编码的内溶素蛋白，研究表明其