Dna三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶dna糖基化酶的高灵敏检测的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测。
【背景技术】
[0002]在过去十几年里，DNA因其具有严格的碱基配对原则而成为一种有趣的组装元素用于可控的、程序化的设计和组装DNA纳米材料。通过合理的序列设计和DNA自组装过程，一系列的动态DNA纳米器件被成功组装，如纳米机器、逻辑门、催化放大器等，它们大多是基于Toehold介导的链置换反应。DNA纳米器件通常是通过pH的调节、核酸杂交以及金属离子与碱基的反应引发的。然而，一般的设计仅仅将一种目标物转化为信号输出，这大大限制了目标物响应的DNA纳米器件的多样化设计。
[0003]典型的DNA三向节是由三条单独的DNA互相杂交形成，它作为一种新型的DNA纳米组装构筑单元被应用于DNA动态自组装中。多臂结构为组装目标物响应的DNA纳米器件提供了更多的可能性。对Toehold介导的链置换反应而言，在不同的三向节臂上安置Toehold和链迀移序列是至关重要的，原因为该种设计可使组装更加灵活，反应更易调节。在DNA三向节活化策略中，最初Toehold序列和链迀移序列是不可接近的，当进行识别反应后，通过某种信号转导机制的引入，即可将该识别事件转化为三向节的活化过程。最近，DNA三向节活化策略被成功用于目标物诱导的DNA环路和逻辑门中。然而，在该类设计中仍存在诸多限制，Toehold和链迀移序列通过一段完整的适体链连接或被劈开成两条DNA链，这就只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件，如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合等。因此，构建功能先进且能识别多种目标物的DNA纳米器件仍是个巨大的挑战。
[0004]核酸酶，如DNA修饰酶，在调节基因表达和维持基因完整性上起重要作用。DNA修饰酶的异常表达可能干扰基因形式的遗传外重新编程进而影响核染色质结构，引起许多疾病，如癌症、亨廷顿疾病或精神异常等。然而，DNA修饰酶作用的底物为一段DNA序列或特定的碱基位点，利用DNA修饰酶构建DNA纳米器件的最大障碍即为缺少有效的识别机制，如何将该类酶的作用转化为DNA三向节活化过程，是本领域技术人员面临的难题。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术存在的问题，发明人通过引入新的酶识别机制，可以实现将不同种目标物转化为同一种信号输出的一般性纳米器件的构建。以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了 DNA三向节活化中的发夹重构机制，将DNA修饰酶(UDG)对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建。该器件能够用于DNA糖基化酶UDG的高灵敏检测和抑制剂筛选，证明了该方法具有潜在的应用价值。
[0006]本发明涉及以下技术方案:
[0007]1、一种杂交链式反应方法，包括由DNA修饰酶参与的DNA三向节活化形成DNA三向节触发链，进而引发发卡结构H1、H2的杂交链式反应，其特征在于，DNA修饰酶识别探针与DNA修饰酶作用，识别探针发生发夹重构，继而形成DNA三向节触发链。
[0008]本发明所述的发卡重构是指，DNA修饰酶识别探针是包括toehold、DNA修饰酶的识别序列、链迀移部分、位于DNA修饰酶识别序列两端的两段互补的辅助序列且链迀移部分与识别序列杂交的发卡结构，DNA修饰酶与识别探针结合使得链迀移部分与识别序列的杂交变得极其不稳定，继而探针中两段互补的辅助序列发生配对杂交，原来的发夹结构发生重构，toehold和链迀移部分拉近，形成一个三向节触发链，体系中加入Hl和H2时，三向节结构打开Hl的发夹，进而形成Hl和H2交替组装的双链结构。
[0009]本领域技术人员明了，不同类型的DNA修饰酶可以通过不同的方式使得识别序列发生碱基变化，即而引发识别探针的发卡重构，优选的，识别探针设计为，加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)后，识别序列中的U被移除，生成无碱基位点(AP site)，使链迀移部分与UDG识别序列的杂交变得极其不稳定，这时，两端互补的辅助序列杂交，使原来的发夹发生重构。
[0010]2、一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的尿嘧啶DNA糖基化酶检测方法，其特征在于，
[0011](I)制备UDG识别探针、HU H2，其中UDG识别探针是包括toehold、UDG酶识别序列、链迀移部分、位于UDG酶识别序列两端的两段互补的辅助序列且链迀移部分与识别序列杂交的发卡结构，识别探针与UDG酶结合可使得链迀移部分与识别序列的杂交变得极其不稳定，继而探针中两段互补的辅助序列发生配对杂交，原来的发夹结构发生重构，toehold和链迀移部分拉近，形成一个三向节触发链；
[0012](2)加入UDG酶，进行杂交链式反应；
[0013](3)对反应结果进行信号检测。
[0014]优选的，上述检测方法在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)与识别探针作用前，进行DNA的退火，包括UDG识别探针、杂交链式反应的Hl和H2的退火，使UDG酶识别探针、Hl和H2均形成稳定的非活化状态发夹结构。
[0015]优选的，杂交链式反应中形成的双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构，作为信号报告元件，通过加入荧光染料NMM进行信号检测。
[0016]优选的，识别探针的序列为CTT GCA ATT GTGA UTUTGT CTCAC TT ACAA AA ACGTTACC, Hl 的序列为 ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTA ACGT GTTC GTTGTAAT TGCA AGG, H2 的序列为 TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGT TCGTT GT GCAATTACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
[0017]优选的，识别探针的浓度为250ηΜ，Η1的浓度为500nM，H2的浓度为550nM ;杂交链式反应的组装时间采取120min。
[0018]3、一种利用上述检测方法进行尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于:在步骤(2)中，额外加入不同浓度的候选抑制剂后，进行杂交链式反应。
[0019]4、一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的尿嘧啶DNA糖基化酶检测试剂盒，其特征在于，包括UDG酶识别探针、Hl和H2，信号检测试剂，所述UDG识别探针是包括toehold,UDG酶识别序列、链迀移部分、位于UDG酶识别序列两端的两段互补的辅助序列且链迀移部分与识别序列杂交的发卡结构，识别探针与UDG酶结合可使得链迀移部分与识别序列的杂交变得极其不稳定，继而探针中两段互补的辅助序列发生配对杂交，原来的发夹结构发生重构，toehold和链迀移部分拉近，形成一个三向节触发链。
[0020]优选的，识别探针的序列为CTT GCA ATT GTGA UTUTGT CTCAC TT ACAA AA ACGTTACC, Hl 的序列为 ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTA ACGT GTTC GTTGTAAT TGCA AGG, H2 的序列为 TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGT TCGTT GT GCAATTACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
[0021]优选的，识别探针的浓度为250ηΜ，Η1的浓度为500nM，H2的浓度为550nM ;杂交链式反应的组装时间采取120min。
[0022]本发明取得了以下技术效果:
[0023](I)本发明引入新的酶识别机制，提供了新的DNA三向节活化策略。
[0024](2)本发明所述的DNA三向节活化策略，克服了现有技术中只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件的限制(如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合)。
[0025](3)本发明以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了发夹重构机制，将DNA修饰酶酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，引起DNA的自组装过程，实现了一类酶底物的通用性DNA纳米器件的构建。
[0026](4)本发明所述方法针对尿嘧啶DNA糖基化酶实现了高灵敏检测，其中UDG的检测下限达到0.0