流感核蛋白疫苗的制作方法

流感核蛋白疫苗的制作方法
【专利说明】流感核蛋白疫苗
[0001] 背景
[0002] 存在改进流感疫苗的需要。目前针对流感的疫苗策略集中在生成针对血凝素的稳 固的抗体（体液的）反应。由于在一年的过程中循环流感病毒株中高度的抗原性漂移，对 于每个流感季必须特定地重新配制疫苗株。虽然年度（或季度）流感疫苗对于不同年龄类 别的变化程度是成功的，显然对于年幼和年老者特别需要更有效的保护。此外，存在再造病 毒会进化的重大、永久的风险，其在称为"抗原性漂移"的过程中获得非常不同的HA(血凝 素）基因。这会产生公共健康紧急情况，因为目前的流感疫苗基本上依赖于HA抗原。
[0003] 流感病毒是病毒的正粘病毒科（Orthomyxoviridae)中一种有包膜的、单链、负链 RNA病毒，分为3个主要类型A、B和C。流感A病毒感染多种多样的动物，包括人、鸟类、猪、 马、蝙蝠等等，尽管任何特定的流感病毒的趋向性通常高度适应于特定宿主。流感B病毒感 染较小数目的物种，即人和海豹，但仍然是年度流行性感冒的重要原因。大多数人流感感染 是通过流感病毒A或B引起的；而感染人和猪的流感C病毒罕见导致严重的人感染或流行 (Lamb)〇
[0004] 目前失活的流感病毒疫苗诱导抵御紧密相关的病毒株的抗体。目前得到许可的疫 苗主要诱导针对血凝素（HA)的菌株-特异性的中和抗体，病毒表面上的主要抗原性决定簇 其为高免疫原性的，并可预防由匹配病毒株的感染引起的疾病。然而，HA具有重要的抗原 变异，其排除其单独用于经设计以提供光谱防护（broadprotection)的疫苗。为此，针对 较少可变的靶物生成保护反应的可替换的疫苗策略是非常感兴趣的。
[0005] 用流感A病毒的天然感染诱导体液和细胞免疫性两者。持久的细胞免疫性主要针 对保守的、内部病毒蛋白，如核蛋白（NP)。在天然感染后NP抗原在人中是免疫原性的，但诱 导的细胞毒性T淋巴细胞具有短的寿命（McMichaela，McMichaelb)。
[0006] 针对NP的细胞免疫性是有价值的，因为其针对NP表位的不同变体，且靶向NP的 DNA疫苗在动物中具有诱导的交叉-保护的免疫性（Schotsaert)。
[0007] 核蛋白（NP)抗原已长期被识别为高度保守的抗原：甚至是最歧化的（divergent) 流感病毒A株在它们编码的NP蛋白中共享90%同一性（Gorman，Xu)。对NP的抗原性变化 是罕见的且仅仅在较小程度发生（Stanekovd)。 现有技术
[0008] 使用核蛋白作为疫苗中的抗原
[0009] 流感核蛋白用作抗原描述于1980年代（Wraith)。小鼠中针对NP的细胞免疫响应 能够诱导免疫性，且能够显著地产生针对分歧的A型病毒的交叉保护。显示用由H3N2病毒 纯化的NP免疫小鼠可提供免于致死性异源（H1N1)攻击的实质保护（75%)，但它不能防止 感染。
[0010] 使用NP基因的DNA疫苗已知20年：将它们用于第一"概念证明"实验用于DNA免 疫本身（Ulmer)。
[0011] NP从病毒载体的表达首次在1980年代证明（Yewdell1985)，且用此载体免疫与 细胞毒性T淋巴细胞针对分歧的流感病毒A株而非B株与DNA疫苗相比改进的生成相关。
[0012] 自此，已显示用表达PR8核蛋白的MVA载体免疫小鼠保护它们抵御异亚型流感病 毒（Altstein)的低剂量攻击。更近些，已将一种编码融合于Ml蛋白的NP蛋白的病毒载体 用于免疫人（Lillie,Berthoud，Antrobus)。这些研究显著地显示：当体液反应通过免疫衰 老（immunosenescence)下降时，对于NP的细胞免疫响应可在较年长的人中被实质地增强 (Antrobus)〇
[0013] 核蛋白的分泌
[0014] 一些研究已表明NP蛋白起初位于核中，减少这些DNA疫苗的免疫原性 (Stanekovd)〇
[0015] 改进的针对NP的细胞免疫响应可通过强制分泌NP，例如通过将tPA信号肽融合于 NP基因（Luo)、通过配制DNA(Greenland,Sullivan)以及通过使用电穿孔（Laddy)以改进 DNA递送来获得。
[0016] 单体流感核蛋白
[0017] 单体抗原在与C4bp寡聚域的融合体中的优选使用描述于专利申请 TO2005/014654中。但单体化抗原使用中的风险是它们降低的免疫原性。这由Bachmann和 同事用水泡性口膜炎病毒的糖蛋白G证明（Bachmann1993)，并且用于流感抗原神经氨酸 酶，或NA，由Fiers和同事证明（Fiers2001)。可预期的是减少或去除来自流感核蛋白的 更高级结构会降低它们的免疫原性。
[0018] 已显示多种突变使流感核蛋白转变，其自然寡聚化为单体形式（Ye2006)。在此 2006文章中所述的NP的单体形式在更近期的文章中确认为单体的（Tarus,Ye2012)。这 些文章中所述的赋予流感病毒A株的核蛋白单体的两个点突变在流感病毒B和C株的核蛋 白中是保守的（参见Nakada中图3)。因此，可将相同的点突变引入流感病毒B和C株的核 蛋白，从而赋予这些其他流感核蛋白单体。但是没有进行单体核蛋白的免疫原性的研究。
[0019] 用NP抗原制备流感疫苗中的主要技术问题是诱导强而且持久的细胞免疫响应。 所述"细胞免疫响应"是一种免疫响应，其不涉及抗体，但涉及抗原-特异性T-淋巴细胞 (且特别是细胞毒性T淋巴细胞）的活化和多种细胞因子响应于抗原的释放。CD4细胞或 辅助性T细胞通过分泌活化免疫响应的细胞因子而提供针对不同病原体的保护。细胞毒性 T细胞（CD8)引起由于病原体的凋亡所致的死亡而不需使用细胞因子。
[0020] 尽管对于针对NP的CD4或CD8响应是否对于保护是更重要的仍然有争议 (Epstein)，但存在共识，即对于核蛋白的细胞反应而非体液反应对于此抗原可诱导的保护 是关键的（Thomas)。当T细胞表位源自高度保守的NP蛋白时，通过引发强细胞毒性T细胞 响应提供保护的疫苗可为有用的（Epstein;Roy)。由T淋巴细胞介导的细胞免疫响应主要 通过识别流感病毒-感染的细胞、通过抑制病毒复制以及通过加速病毒清除而发挥功能。
[0021] 赋予免疫性所涉及的特异性T细胞包括⑶4+和⑶8+T细胞两者，并常常分别通过 分泌的细胞因子和细胞裂解活性的作用来发挥它们的功能。流感NP-特异性CD8+CTL特别 能够在针对小鼠中致死性流感病毒攻击的异亚型保护性免疫性起重要作用（Gschoesser)， 包括流感病毒从上呼吸道粘膜表面的清除（Mbawuike)，促进攻击后的存活和恢复 (Epstein)。最佳的基于NP的疫苗可改进CD4和CD8细胞反应两者。
[0022] 本专利申请提供用于改进对于流感病毒核蛋白的细胞免疫响应的方法。
[0023] 发明简述
[0024] 本发明涉及用于增加来自流感病毒的NP抗原的免疫原性（特别是细胞免疫原性） 的方法，即，将来自流感病毒株A、B或C的NP抗原的至少一种变体融合于作为载体蛋白的 鸡（chicken)C4bp寡聚化域的变体。
[0025] 本发明具体涉及融合蛋白，其包含来自流感病毒株A、B或C的NP抗原的至 少一个单体变体和具有如SEQIDN0:1中所示序列的载体蛋白IMX313,如专利申请 W02007/062819 中所述。
[0026] 本发明具体涉及融合蛋白，该融合蛋白包含来自流感病毒株A的NP抗原的单体变 体，其呈现如SEQID勵:2所示的￡3394和1?4164点突变，和0?313载体蛋白的变体，其具 有包含序列ZXBBBBZ的至少一个带正电的肽的C-端取代，其中（i)Z是任何氨基酸或是缺 失的，（ii)X是任何氨基酸和（iii)B是精氨酸（R)或赖氨酸⑷，如SEQIDN0:3中所示， 如2013年12月11日提交的专利申请PCT/EP2013/076289中所述。頂X313载体蛋白的优 选变体不诱导与鱼精蛋白交叉反应的抗体。
[0027] 本发明具体涉及融合蛋白，其包含NP抗原的单体变体，和修饰的载体蛋白 頂X313T或頂X313P，如分别在SEQIDN0:4和SEQIDN0:5中所示。
[0028] 本发明还涉及免疫原性组合物，其包含质粒或病毒载体中的DNA序列，还包含信 号肽，如tPA，如SEQIDN0:6中所示。
[0029] 本发明还涉及编码所述融合蛋白的重组DNA序列。
[0030] 本发明还涉及免疫原性组合物，其包含由质粒或病毒载体编码的DNA序列，或融 合蛋白，还包含用于胞内TLRs的核酸配体或疫苗佐剂，如2013年12月11日提交的专利申 请PCT/EP2013/076289 中所述。
[0031] 本发明还涉及DNA质粒、病毒载体、融合体或免疫原性组合物，其用作疫苗或免疫 疗法，作为预防或治疗流感的方法。
[0032] 发明详述
[0033] 在详细描述本发明之前，可理解的是本发明并不局限于具体例示的方法，并且当 然可以变化。特别是，本发明涉及包含来自流感病毒的至少一个核蛋白抗原的融合蛋白，并 且不限于特定的流感核蛋白。
[0034] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是下文或上文，都通过提述以它们 的整体并入本文。然而，引用文本提及的出版物是为了描述和公开在所述出版物中报道的 并且可能相关于本发明使用的规程、试剂和载体。
[0035] 此外，除非另外指示，本发明的实施采用常规的蛋白纯化和本领域技术范围内的 分子生物学技术。这些技术是技术人员已知的并且在文献中充分地解释。在所附权利要 求和本发明的连续描述中，除了由于表述语言或必需含意而上下文有另外要求外，单词"包 含（comprise) "、"含有（contain) "、"包涵（involve)" 或"包括（include)" 或变型如"包 含（comprises) "、"包含（comprising)"、"含有（containing) "、"包涵（involved) "、"包括 (includes) "、"包括（including) "以涵盖的意义使用，S卩，以详明所述特征的存在，而不排 除其他特征在本发明的多个实施方案中的存在或添加。
[0036] 定义如下术语用于更好地理解本发明：
[0037] 流感病毒有三种类型A、B和C。此分类起初是血清学的：对流感病毒A核蛋白的 抗血清与其他A型病毒的核蛋白交叉反应，但不与B型或C型病毒的那些交叉反应。流感A病毒基于它们的血凝素（H)和神经氨酸酶（N)糖蛋白的血清学交叉反应进一步分成多个 亚型。
[0038] "流感核蛋白"意指流感病毒的全部三种类型（A、B和C)的核蛋白。
[0039] "载体蛋白（carrierprotein) "通常指抗原与之缀合或融合并由此赋予更多免疫 原性的蛋白。本文该术语特定地在携带抗原的蛋白的涵义中使用。蛋白的功能在于增加与 之缀合或融合的所述抗原的免疫原性。
[0040] "NP的变体"指所有具有序列的蛋白，所述序列与来自流感病毒株A、B和C的流感 核蛋白的野生型形式具有至少90%的同一性。
[0041] "鸡C4bp寡聚化域的变体"是2013年12月11日提交的专利申请W02007/062819 和PCT/EP2013/076289 (两篇文献通过提述并入本文）中所述的SEQIDNO: 1的C4bp域的 变体，特别是至少48个连续氨基酸的片段和/或与专利申请W02007/062819中所述的SEQ IDNO: 1具有至少70%氨基酸序列同一性（的变体）。
[0042] "頂X313载体蛋白的变体"描述于2013年12月11日提交的专利申请PCT/ EP2013/076289 中。
[0043] 鱼精蛋白由一组具有4500道尔顿的平均分子量的从鱼获得的异源肽组成。鱼精 蛋白的氨基酸组成的大约67%是精氨酸。它长期用于配制胰岛素（于中性鱼精蛋白锌胰岛 素（NeutralProtamineHagedorn))，或用于中和肝素。
[0044] 术语"融合蛋白"指重组蛋白，其非天然存在，包含来自不同来源的已融合的两个 域。更精确地，在本发明中，融合蛋白包含融合于鸡C4bp寡聚化域的载体域变体（特别是 '頂X313T'或'頂X313P'）的流感核蛋白抗原。融合体具有产生同源产物的优势。更正式 地，"缀合"可描述为遗传的：将编码原-免疫原性载体蛋白的DNA剪接至编码抗原的DNA。 可将抗原融合至载体蛋白的N-或C-端。
[0045] 本发明涉及免疫原性组合物，其包含流感核蛋白抗原的至少一个变体抗原和C4bp 寡聚化域的变体，并引发增加的针对流感核蛋白抗原的细胞免疫响应。
[0046] 根据本发明，融合于鸡C4bp寡聚化域的载体蛋白变体（特别是IMX313T或 頂X313P)的核蛋白可为来自流感病毒的任何类型（A、B或C)的核蛋白。
[0047] 可将核蛋白抗原融合于载体蛋白（特别是頂X313T或頂X313P)的N-或C-末端。
[0048] 根据本发明，至少一个核蛋白融合于一个载体蛋白，特别是頂X313T或頂X313P; 然而，两个或多个核蛋白（相同的或不同的）可融合于相同的载体蛋白。
[0049] 根据本发明的优选的方面，融合于鸡C4bp寡聚化域的变体（特别是IMX313T 或頂X313P)的核蛋白抗原是单体抗原。实际上，使用单体抗原是有利的，如专利申请TO 2005/014654中所述，条件是单体化不减少它们的免疫原性。而且，NP在结晶中形成三聚体 (Ye2006)和体内的其他寡聚体（Arranz,Moeller)。三聚或寡聚蛋白融合于七聚体蛋白如 頂X313T或頂X313P面临产生空间冲突（stericclashes)的风险。另一方面，天然寡聚蛋 白的单体形式具有减少的免疫原性（Fiers)。
[0050] 为了获得单体核蛋白抗原，本领域的技术人员知晓可引入NP抗原的蛋白序列以 诱导其单体化的不同的点突变。具体地，NP抗原呈现两个下述点突变中的至少一个：E339A 和R416A。
[0051] 在本发明的一个实施方案中，NP抗原来自流感病毒株A。
[0052] 在本发明的一个优选的实施方案中，NP抗原包含两个点突变E339A和R416A，并且 因此为单体的。
[0053] 在本发明的另一个实施方案中，NP抗原呈现如SEQIDN0:2中所示的多肽序列。
[0054] 对从DNA疫苗表达的抗原的增加