在大肠杆菌的细胞质和/或培养基中表达真人类表皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长 ...的制作方法
【专利说明】在大肠杆菌的细胞质和/或培养基中表达真人类表皮生长 因子和/或碱性成纤维细胞生长因子的手段和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年4月3日提交的美国专利申请No. 61/808,062的优先权，将其 公开的内容整体合并于本申请中。
[0003] 序列表
[0004] 如上即时申请包括序列表，通过整体引用的方式合并于此。
技术领域
[0005] 本申请涉及在大肠杆菌（Escherichiacoli)的细胞质和/或培养基中表达真 (authentic)人类表皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子的手段和方法。
【背景技术】
[0006] 虽然大肠杆菌不能进行翻译后修饰，但大肠杆菌仍然是用来生产重组人类治疗性 蛋白最常用的宿主系统。在这些蛋白中，包括表皮生长因子（EGF)和碱性成纤维细胞生长 因子（bFGF)在内的皮肤蛋白不需要翻译后修饰，例如维持生物活性和稳定性的糖基化修 饰，这些皮肤蛋白已经使用多种策略在大肠杆菌中得到了表达。
[0007] 可能是由于尺寸小，EGF已经在大肠杆菌中得到了高效表达、分泌甚至外排 (excrete)到培养基中。外排的EGF不仅被证实是有生物活性的，更重要的是，其还显示出 具有正确的初级（真）结构。此外，由于通过外排生产EGF不需要破坏细胞，所以外排生产 的EGF可以免于内毒素的污染。另外，培养基中低水平的细胞质蛋白极大促进了EGF的纯 化以达到高同质性。重要的是，这个过程高度可重复并易于扩展。
[0008] 对于bFGF，尽管它具有分泌性，但是它并没有通过分泌或外排在大肠杆菌中获得 成功表达。传统地，bFGF在大肠杆菌中的表达通过使用融合的方式已被局限于细胞质，在 这种方式中，bFGF的回收依靠细胞的裂解、融合中间体的蛋白水解消化和通常通过亲和层 析进行的后续纯化。bFGF的细胞内表达会导致高的生产成本，因为它要么需要昂贵的蛋白 酶以切割融合产物，要么在内含物聚合体（inclusionaggregates)形成时需要劳动密集型 的方案来再生bFGF。尽管有这些操作，但是bFGF在大肠杆菌中的表达仍没有圆满完成，因 为生产的产物被证实未被正确加工或者没有生物活性。
[0009] 之前已经尝试使用其它的重组系统来生产bFGF。其中一种尝试是关于枯草芽孢杆 菌（Bacillussubtilis)工程来促进bFGF的分泌生产。通过使用能够精准的对融合前体 进行肽酶加工的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens)蛋白酶基因的NPR信号肽，并结 合一种温和的破坏细胞壁稳定性的方案，具备真正结构和完全的生物活性的bFGF被证实 分泌到了枯草芽孢杆菌的培养基中。
[0010] 本发明提供了一种可替代的和/或改进的方法和系统，以用于可靠且高效地生产 bFGF和/或其它有用的多肽。
【发明内容】
[0011] 根据本申请的第一方面，提供了一种DNA构建体，以用于在大肠杆菌中生产至少 第一多肽，其中，所述第一多肽是真碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)，其中，所述DNA构建 体中包括插入片段，所述插入片段按顺序包括表达盒、内含肽序列和编码碱性成纤维细胞 生长因子（bFGF)的DNA，其中，所述DNA构建体被配置成能够使宿主分泌碱性成纤维细胞生 长因子（bFGF)在宿主的细胞质中和/或外排到培养宿主的细胞培养基中。
[0012] 优选地，所述DNA可以包含编码第二多肽的DNA，其中，编码第二多肽的DNA可以 被安排在表达盒和内含肽序列之间。编码第二多肽的DNA以可以编码真人类表皮生长因子 (EGF)。所述DNA构建体可以被配置成能够使宿主以非融合多肽的形式分泌第一和/或第 二多肽。
[0013] 在一种实施方式中，所述内含肽序列可以是SeeVMA内含肽序列。
[0014] 在一个实施方式中，所述表达盒可以包括启动子序列，操纵子序列，用于共有核糖 体（consensusribsome)结合位点的序列和前导序列。在具体的实施方式中，所述表达盒 可以按顺序包括启动子序列、操纵子序列，用于共有核糖体（consensusribsome)结合位点 的序列和如导序列。在另一种具体的实施方式中，所述启动子序列可以是lacUV5启动子 (lacUV5)，操纵子序列可以是lac操纵子（lacO)，前导序列可以是ompA前导序列（ompA)。
[0015] 根据本发明的第二方面，提供了一种用来至少生产碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的生物工程系统，其中，所述系统为大肠杆菌宿主，并且其中，所述系统适用于通 过分泌到细胞质中和/或培养所述系统的培养基中的方式生产碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 〇
[0016] 优选地，所述系统可以包括以上描述的DNA构建体。
[0017] 所述系统可以被配置成以非融合多肽的形式生产第一多肽。
[0018] 所述系统可以被配置成以非融合多肽的形式生产第二多肽。
[0019] 根据本发明的第三方面，提供了一种生产碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的方 法，所述碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)为大肠杆菌宿主的细胞外产物和/或来自大肠杆 菌宿主的细胞质，该方法包括在DNA构建体中使用内含肽以促进所述bFGF表达的步骤。
[0020] 优选地，所述内含肽可以是SeeVMA内含肽。
[0021] 在一种实施方式中，所述方法可以适用于在相同的大肠杆菌宿主中以非融合多肽 的方式共表达bFGF和真人类表皮生长因子（EGF)。
[0022] 在一种实施方式中，所述方法可以包括在在宿主细胞质中和/或培养宿主的细胞 培养基中生产bFGF和/或EGF的步骤。
[0023] 优选地，所述方法提供：在DNA构建体中，将内含肽置于bFGF和EGF的DNA编码序 列之间的步骤。
[0024] 在一种实施方式中，bFGF和EGF的DNA编码序列可以置于相同的DNA构建体中。
【附图说明】
[0025] 图1是展示用在引导本发明的研究中DNA构建体的示意图。中的上部分展示了使 用的3种DNA质粒，SP(A)pWKW2FGFR、（B)pWKW20VMA和（C)pWK3R。基因元件的符号如下所 示：bfgf=bFGF基因；VMA=SceVMA内含肽的编码序列；egf=EGF基因；ori=大肠杆菌 中的复制起始位点；ampR =氨节青霉素抗性基因。图下部分展示了LacUV5表达盒的5'端 区域，按包括lacUV5启动子（lacUV5)、lac操纵子（lacO)、共有核糖体结合位点 (RBS)和ompA前导序列（ompA)。箭头指示了从lacUV5启动子的转录方向。所述箭头指示 了从lacUV5启动子的转录方向。位于图的最下部分的图（D)展示了在构建体pWKW20VMA 和PWK3R中，在VMA内含肽融合边界的DNA编码序列和氨基酸序列。
[0026] 图2是多种质粒构建体表达的bFGF和EGF的蛋白印迹（WesternBlot)的示意 图。将在IPTG诱导下生长8小时的含有pWK3R、pWKW20VMA和pWKW2FGFR三种构建体的大 肠杆菌培养物分离成细胞上清液（SN)和细胞裂解液（CL)制品（preparation)。通过使用 抗：[凝胶（A)]bFGF和MazG(内参）；[凝胶⑶]bFGF、EGF和MazG的抗体（antibodies raisedagainst)的蛋白印迹来分析样品的bFGF和EGF产物。样品也用考马斯亮蓝 R-250进行染色，并展示在凝胶C中。展示了未成熟的（premature)bFGF(OmpA-bFGF)和 未成熟的EGF(OmpA-EGF)的中间体，对应的，也展示了成熟的bFGF(Mat-bFGF)和成熟的 EGF(Mat-EGF)产物。SN和CL的上样量分别相当于细胞培养物的10y1和5y1。所述三 种构建体的名称显示在凝胶图片下方来表示制备的分离样品所来自的细胞培养物。表明 了图2a(泳道2和3)以及图2b(泳道3和4)所示的是前体OmpA-EGF-VMA-bFGF(A)和 EGF-VMA-bFGF( )。其他使用的符号：M=蛋白分子量标准；+VE=作为阳性对照的bFGF 或bFGF和EGF标准物。
[0027] 图3是两张展示通过MALDI-T0F测定的纯化EGF的质量图。展示分析（见方法）： (a)具有天然的初级结构的商业化的EGF标准物；(b)从JM101(pW3R)培养物（见方法中的 生长和诱导条件）的SN纯化得到的EGF。表明主峰在6213至6217的区域处具有的质荷比 (m/z)是期望从真EGF在两处得到的。（a.u.)表示任意单位。
[0028] 图4是两张展示EGF和bFGF的生物测定的图。成熟的EGF和bFGF样品是从诱导 的JM101 [pWK3R]的培养上清液中纯化得到的（见方法中的生长和诱导条件）。EGF和bFGF 对BALB/C3T3纤维原细胞增殖的有丝分裂影响的分析在方法中做了描述。两种成熟因子 r'f:):的生物活性与具有正确初级结构的EGF和bFGF标准物（ _t_ )的生物活性做了比 较。两个测试都得到了能够重合的曲线。每个测试重复四次<〇.〇5);以及
[0029] 图5是两张展示成熟的bFGF和成熟的EGF在JM101[pWK3R]培养物中共表达的图。 JM101[pWK3R]培养物的生长和诱导条件在方法中做了描述。顶部图表示了：在SN中成熟 的bFGF的浓度（-□-)，在CL中成熟的bFGF的浓度（-?-)，在SN中成熟的EGF的浓度 (一A-)，以及在CL中成熟的EGF的浓度（==?==)。表示出的结果是四次不同实验 的平均值土SEM值。底部图表示了：普通琼脂平板（plainagarplate)上收获的活细胞数 添加有氨苄青霉素的琼脂平板的活细胞数（--) ;CFU指的是细胞形成单 位。
【具体实施方式】
[0030] 大肠杆菌被用来在细胞外生产多种不同来源、功能和尺寸的自然分泌的蛋白。引 导本发明的研究提供了在大肠杆菌中通过细胞分泌/外排的方式表达真bFGF的机制，该机 制在之前是不可能的或者