一种从红豆杉叶中提取紫杉醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种从红豆杉叶中提取紫杉醇的方法，属于植物提取物的分离纯化领域。
【背景技术】
[0002]红豆杉是一种珍贵的药用植物，为世界珍稀濒危树种，国家一级保护植物，被誉为“植物黄金”。南方红豆杉枝叶的次生代谢代谢产物中，其药用价值中除含有极少量的紫杉醇成分已在临床上广泛用于治疗各种恶性肿瘤，被认为是最好的抗癌药之一。
[0003]由于红豆杉枝叶中含有大量的色素、蜡质油脂及相似物质等杂质，这些杂质使得紫杉醇的分离提取操作更为复杂，传统从红豆杉树皮中提取紫杉醇的方法根本无法适用。为此，本领域的各大企业不惜花费巨额资金组织科研人员进行了大量、反复的研究，各种研究成果在公开出版物上屡见报道。
[0004]这些技术虽能从红豆杉的枝叶中有效分离提取紫杉醇，但其纯化效果非常不理想，无法直接达到药用标准(中国药典2010年版)，需要进行后续的纯化操作，从而增加紫杉醇的提取成本，提取效率低，不能适宜规模批量化生产，且在提取过程中，使用大量有机溶剂，对环境造成严重污染。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前红豆杉枝叶提取过程中，含有大量的色素、蜡质油脂及相似物质等杂质，在分离提取过程中操作复杂，使用大量的有机溶剂，造成环境污染，且提取效率低，提取纯度未达到药用标准，本发明提供了一种从红豆杉叶中提取紫杉醇的方法，本发明首先收集红豆杉主根周围土壤，通过使用水解络蛋白等物质对土壤内的微生物进行培养，再使用红豆杉落叶做营养物，对土壤内的微生物进行筛选，最后与新鲜红豆杉叶进行发酵，再进行甲醇稀释，提纯等步骤得到纯度在99.6%的紫杉醇。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)取红豆杉主根周围I?3cm处的土壤放入容器中，按重量份数计，取45?65份的蛋白琼脂、5?10份的水解络蛋白、4?8份的氯化钾、10?15份的腐殖质及18?20份去离子水，搅拌均匀并加入容器中，加入量为土壤质量的10?25%，搅拌均匀，使用质量分数为10%的氯化氢溶液调节其pH为6.0?6.5 ;
(2)待上述调节pH完成后，密封容器，搅拌7?10天，保持温度为28?35°C，含水量为16%，转速设定为120?150r/min，在此过程中每4?6h向容器内通氧气，氧气通入量为容器体积的30?40%，搅拌结束后，向容器内每10?15h加入红豆杉落叶，加入量为土壤质量的20?25%，混合均匀，如此培养15?20天；
(3)上述培养结束后，将容器内的土壤移至发酵池内，按与土壤质量比1:3，加入新鲜红豆杉叶，搅拌均匀，密封发酵12?14天，保持温度为28?35°C，发酵池内部含水量为15?20%，发酵池内部空气中氧气含量为5?8% ； (4)待上述发酵结束后，向其中加入甲醇，淹没发酵物3?6cm，在转速1000?1200r/min下，搅拌40?45min，然后静置I?2h，收集液体，将所得的液体放入离心机中离心分离，收集上清液；
(5)将上述所得的上清液通过硅胶柱分离，流动相为正己烷，洗脱速度为I?3个柱体积/小时，洗脱液用量为8?10个柱体积，将柱层析收集的馏分，浓缩蒸干，然后向其中加入去离子水，加入量为甲醇体积的80?110%，放置24?26h后过滤，将过滤物再减压烘干，即可。
[0007]本发明的有益效果是:
(1)本发明使用生物法对红豆杉叶进行预处理，对环境无污染；
(2)本发明所制得的紫杉醇纯度达到99.6%以上；
(3)本发明制作成本与传统方法相比，降低了10?20%，易于操作。
【具体实施方式】
[0008]取红豆杉主根周围I?3cm处的土壤放入容器中，按重量份数计，取45?65份的蛋白琼脂、5?10份的水解络蛋白、4?8份的氯化钾、10?15份的腐殖质及18?20份去离子水，搅拌均匀并加入容器中，加入量为土壤质量的10?25%，搅拌均匀，使用质量分数为10%的氯化氢溶液调节其pH为6.0?6.5 ;待上述调节pH完成后，密封容器，搅拌7?10天，保持温度为28?35°C，含水量为16%，转速设定为120?150r/min，在此过程中每4?6h向容器内通氧气，氧气通入量为容器体积的30?40%，搅拌结束后，向容器内每10?15h加入红豆杉落叶，加入量为土壤质量的20?25%，混合均匀，如此培养15?20天；上述培养结束后，将容器内的土壤移至发酵池内，按与土壤质量比1:3，加入新鲜红豆杉叶，搅拌均匀，密封发酵12?14天，保持温度为28?35°C，发酵池内部含水量为15?20%，发酵池内部空气中氧气含量为5?8% ;待上述发酵结束后，向其中加入甲醇，淹没发酵物3?6cm，在转速1000?1200r/min下，搅拌40?45min，然后静置I?2h，收集液体，将所得的液体放入离心机中离心分离，收集上清液；将上述所得的上清液通过硅胶柱分离，流动相正己烷，洗脱速度为I?3个柱体积/小时，洗脱液用量为8?10个柱体积，将柱层析收集的馏分，浓缩蒸干，然后向其中加入去离子水，加入量为甲醇体积的80?110%，放置24?26h后过滤，将过滤物再减压烘干，即可。
[0009]实例I
取红豆杉主根周围Icm处的土壤放入容器中，按重量份数计，取47份的蛋白琼脂、10份的水解络蛋白、8份的氯化钾、15份的腐殖质及20份去离子水，搅拌均匀并加入容器中，加入量为土壤质量的10%，搅拌均匀，使用质量分数为10%的氯化氢溶液调节其pH为6.0 ;待上述调节pH完成后，密封容器，搅拌7天，保持温度为28°C，含水量为16%，转速设定为120r/min，在此过程中每4h向容器内通氧气，氧气通入量为容器体积的30%，搅拌结束后，向容器内每1h加入红豆杉落叶，加入量为土壤质量的20%，混合均匀，如此培养15天；上述培养结束后，将容器内的土壤移至发酵池内，按与土壤质量比1: 3，加入新鲜红豆杉叶，搅拌均匀，密封发酵12天，保持温度为28°C，发酵池内部含水量为15 %，发酵池内部空气中氧气含量为5 %;待上述发酵结束后，向其中加入甲醇，淹没发酵物3cm，在转速lOOOr/min下，搅拌40min，然后静置