苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽， 包括所述多肽在检测苯噻菌酯中的应用。
【背景技术】
[0002] 苯噻菌酯（benzothiostrobin)是由华中师范大学研发的一种新型Strobilurins 类杀菌剂。苯噻菌酯具有杀菌谱广，杀菌活性高，施用量低，持效期长等优点，具有保护及治 疗作用，对作物白粉病、霜霉病均表现出优越的防效，具有良好的市场开发前景。为预防苯 噻菌酯应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。
[0003] 目前，对苯噻菌酯的残留检测包括仪器分析方法和免疫分析法。免疫检测方法具 有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，在大量样品快速筛选和现场监测中显示出独特优 势。免疫分析通常分为竞争模式和非竞争模式。由于农药等小分子化学品（包括苯噻菌 酯）为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，通常选择竞争模式来建立免 疫分析方法。非竞争分析模式一般需要抗原含有两个或两个以上不重叠抗原决定簇，但是 绝大多数农药与抗体结合之后都会被抗体的结合位点包裹起来，不能直接被第二种抗体所 识别，因此无法建立非竞争分析模式。但是，也有研究者们利用一些新颖的技术或手段建立 了小分子化合物的非竞争免疫分析，并且显示非竞争性免疫分析具有更好的敏感性和特异 性。所采用的方法有制备抗免疫复合体抗体、开放夹心分析法（Open Sandwich Assay)和 筛选抗免疫复合体噬菌体展示多肽。
[0004] 自从噬菌体展示技术第一次报道至今，已经作为一种强大的工具运用在不同的研 究中，包括筛选抗体和酶的配体；筛选小分子的受体；抗体工程等。其原理是将多肽或蛋白 质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确 且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合 蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独 立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。利用免疫复合体（抗体抗原结合 物）对噬菌体展示随机多肽库进行生物淘选，可筛选出能够与免疫复合体特异性结合的噬 菌体展示多肽，可用于建立非竞争免疫分析方法。一些研究结果表明，非竞争检测模式由于 形成了抗原、抗体和多肽的三元复合机构，能够显著提高检测方法的敏感性和特异性。虽然 非竞争分析模式具有优势，但是该技术还处于研发初期阶段，在建立该分析方法中存在的 最大挑战是抗免疫复合体多肽的筛选。目前为止，尚未见具有与苯噻菌酯免疫复合体特异 性结合的多肽及其应用的研究和报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，及相关多肽在苯 噻菌酯检测中的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
[0007] (1)将蛋白A柱纯化的苯噻菌酯抗体包被在酶标板上，用3% BSA封闭酶标板，将 苯噻菌酯加入形成苯噻菌酯免疫复合体；随后，将噬菌体展示随机环八肽库加入酶标板中 进行亲和淘选，淘选过程按照"吸附-洗涤-洗脱-扩增"的循环进行，一般经过3轮的淘 选，每轮淘选降低包被抗体和苯噻菌酯的浓度；
[0008] (2) 3轮淘选后，挑选48个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，39个阳性克隆进行扩 增、质粒提取、测序，共发现3种序列，其序列如SEQ ID NO 1~3所示序列：Cys Pro Asn lie Trp Pro Glu Ser Trp Cys,Cys Leu His Ser Lys His Thr Tyr Glu Cys,Cys Pro Asp lie Trp Pro Thr Ala Trp Cys ;所述多肽由10个氨基酸组成，包含一个环状肽区域；该环 肽区域由多肽两端的半胱氨酸残基形成的二硫键而被环化。
[0009] 本发明所述的多肽可与苯噻菌酯免疫复合体组合，建立非竞争ELISA，用于苯噻菌 酯在环境与农产品中的残留检测。
[0010] 本发明具有以下有益效果：（1)新颖：与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽 为国内外首次报道；（2)实用：利用本发明提供的噬菌体展示多肽可以快速建立高敏感性 的非竞争ELISA;(3)特异性强：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的非竞争ELISA 与苯噻菌酯类似物的交叉反应均小于0.03% ;(4)准确度高：利用本发明提供的噬菌体 展示多肽实现的非竞争ELISA在农产品中的添加回收率为70. 4-125.0%，变异系数低于 11. 5%，符合残留分析标准；（5)灵敏度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的非竞 争ELISA的饱和信号中浓度（SC 5。）为2. 27ng/mL，检测限（SC1Q，L0D)为1. llng/mL。
【附图说明】
[0011] 图1是挑选的48个噬菌体克隆P-ELISA检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐 标为〇D 45。值；
[0012] 图2是非竞争P-ELISA检测苯噻菌酯，0D值与苯噻菌酯浓度的曲线；横坐标为苯 噻菌酯的浓度，单位为ng/mL;纵坐标为0D45。值。
【具体实施方式】
[0013] 本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：
[0014] 主要实验材料：
[0015] 蛋白A柱纯化苯噻菌酯单克隆抗体由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与 环境毒理实验室制备；噬菌体展示随机环八肽库由美国加州大学-戴维斯分校，Hammock实 验室提供。
[0016] 主要试剂：
[0017]蛋白胨（0X0ID)、酵母提取物（0X0ID)、琼脂（Amresco)、琼脂糖（Amresco)、四甲基 联苯胺（Sigma)、IPTG (Amresco)、Xgal (Amresco)、PEG8000 (Sigma)、辣根过氧化物酶标记的 抗Ml3单克隆抗体（GE)
[0018] 主要试剂配方：
[0019] 1、LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl。高压灭菌，室温贮存；
[0020] 2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时， 加入lmL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4°C避光贮存；
[0021] 3、顶层琼脂：每升含lOg蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉，高压灭菌，固 体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
[0022] 4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50%乙醇中，-20°C避光贮存，用前摇匀；
[0023] 5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时，加入 lmL四环素贮液，混匀倒平板，平板4°C避光贮存；
[0024] 6、封闭液：含有 3% BSA，0. 15M，pH 7. 4PBS，过滤除菌，4°C保存；
[0025]7、PEG/NaCl : 20 % (w/v) PEG-8000，2. 5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；
[0026] 8、IPTG/Xgal 配方：将 1. 25g IPTG (isopropyl 0-D-thiogalactoside)和 lg Xgal 溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20°C避光贮存；
[0027] 9、显色液（四甲基联苯胺-H202底物溶液）：25mL 0? 1M，pH 5. 5柠檬酸盐缓冲液 中加入0. 4mL，6mg/mL四甲基联苯胺，0. lmL 1 % H202。
[0028] 实施例1苯噻菌酯免疫复合体特异性结合多肽的淘选和制备
[0029] 1、与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的噬菌体克隆的淘选
[0030] 按照"吸附-洗涤-洗脱-扩增"的循环进行，经过3轮的淘选，具体操作如下：
[0031] (1)取100 y L 10 y g/mL蛋白A柱纯化的苯噻菌酯抗体加入酶标板中，4°C包被过 夜，共三个孔；
[0032] (2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37°C过夜培养；
[0033] (3)将步骤（1)的酶标板用PBST洗涤5遍，加入300 y L 3 % BSA，37°C孵育1小 时，用PBST洗涤5遍，存放于4°C备用；
[0034] (4)取10 y g/mL的苯噻菌酯加入步骤⑶的酶标板中，室温轻微震荡1小时，用 PBST洗涤5遍；
[0035] (5)将酶标板每孔加入2 X 1011的噬菌体（100 y L)，室温轻微震荡1小时；
[0036] (6)取20mL LB培养基加入250mL三角瓶中，加入ER2738单菌落，37°C培养至(me。。 为 0.01 至 0.05 ;
[0037] (7)将步骤（5)的微孔用PBST洗涤10遍，加入100 y L 0. 2M，pH 2. 2甘氨酸盐酸 缓冲液，室温轻微震荡15分钟；
[0038] (8)收集步骤（7)中的洗脱缓冲液，并用1M，pH 9. 1的Tris-HCl中和，4°C保存；
[0039] (9)取少量中性洗脱液测定噬菌体的滴度（操作方法见滴度测定）；
[0040] (10)剩余的洗脱缓冲液用于扩增，将剩余的洗脱缓冲液加入步骤（6)中的三角瓶 中，37°C摇床培养4至4. 5小时；
[0041] (11)将扩增的噬菌体移入50mL的离心管中，4°C 12000g离心10分钟，取上清。重 复离心一次；
[0042] (12)取上层80%的上清放入离心管中，加入上清1/6体积的20% PEG-8000/2. 5M NaCl，混匀，4°C静置过夜；
[0043] (13)将（12)步骤的混合液4°C 12000g离心15分钟，去上清，重复一次；
[0044] (14)取400 y L PBS溶解步骤（13)的沉淀物用于下一轮的淘选，也可放于4°C短 期（大约三周不会影响滴度）保存，或者加入甘油，放于-20°C长期保存；
[0045] (15)步骤（1)到（14)为一轮淘选和扩增，第二轮和第三轮的淘选和扩增步骤同 上；第二轮，步骤（1)中使用的苯噻菌酯抗体浓度和步骤（4)中苯噻菌酯浓度分别为5 yg/ mL和1 y