一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物免疫技术领域,具体涉及中和破伤风毒素的基因重组全人源单克 隆抗体。
【背景技术】
[0002] 破伤风(Tetanus)是由破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)感染所引起 的,是一种常见的且死亡率很高的人畜共患的严重疾病。破伤风梭状芽孢杆菌广泛地存在 于土壤,灰尘和铁锈等处,在多种动物的消化道和粪便中也都有发现,人群中的携带率最高 可达25%。破伤风梭状芽孢杆菌很容易通过创伤感染人体,例如一般性外伤、妇女生产时的 创伤等。当人被破伤风梭状芽孢杆菌感染之后,在七天左右的潜伏期内,破伤风梭状芽孢杆 菌在厌氧条件下于创口处大量生长繁殖并释放毒素。破伤风毒素通过破坏人体神经细胞而 侵害中枢神经系统,导致患者全身性肌肉强直性痉挛,形成破伤风特有的牙关禁闭、角弓反 张等症状,严重者最后会死于室息及全身性衰竭,死亡率在40% -78%之间。产妇分娩感染 时,其病死率可高达90%以上。
[0003] 破伤风梭状芽孢杆菌为严格厌氧菌,其芽孢可抗高温抗干燥,对大多数防腐剂有 抗性,但对碘的水溶液及中性戊二醛溶液很敏感,可在短时间内被这些试剂杀灭。破伤风梭 状芽孢杆菌可以产生两种外毒素:一种是具有溶血作用的破伤风溶血毒素;另一种是破伤 风痉挛毒素,即常说的破伤风毒素。
[0004] 破伤风毒素是由破伤风梭状芽孢杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质,由1315 个氨基酸组成,相对分子质量为150kDa。破伤风毒素在菌体内表达后是单一的一条蛋白质 链,在分泌过程中被蛋白酶裂解成由二硫键链接的轻链和重链。依据功能的不同,破伤风毒 素分子分为A、B、C三个部分:破伤风毒素的轻链片段为A片段,重链N端的一半为B片段, 另一半为C片段。破伤风毒素的毒性过程一般分为结合、导入和作用三步。研究结果表明, 破伤风毒素的C片段可以和破伤风毒素的受体结合。破伤风毒素的受体一般认为是神经节 苷脂,破伤风毒素的C片段具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能,已被用于研究亚 单位疫苗;B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道,将破伤风毒素的活性片段导入到细 胞内;破伤风毒素的A片段分子是Zn蛋白酶,具有蛋白酶活性,它可以裂解神经细胞膜上 的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白,从而抑制神经递质的释放,使兴奋的冲动不 停传递,导致患者产生强直性痉挛的临床症状。
[0005] 破伤风毒素是已知最毒的毒素之一,经纯化的破伤风毒素对小鼠的致死剂量为 0. 1 ng/kg,对豚鼠的致死剂量为0. 3ng/kg,推测对人的致死剂量为0. 25ng/kg。破伤风类 毒素疫苗作为主动免疫疗法被应用于破伤风的预防。破伤风类毒素是用破伤风梭状芽孢杆 菌菌种在适宜的培养基中培养产生的毒素,经甲醛脱毒、精制并加入氢氧化铝佐剂后可以 制成疫苗。虽然注射破伤风疫苗可以完全预防破伤风的临床症状,但由于没有接种疫苗或 免疫效应过期从而导致破伤风杆菌感染的情况依然非常普遍。
[0006]破伤风毒素毒性极强,作用迅速。当病人被确诊为感染破伤风杆菌后,由于此时体 内已有大量细菌和毒素,使用抗菌素已来不及拯救病人生命。因此预防和治疗方法破伤风 的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素的抗体,与毒素进行中和反应而使毒素失活, 并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。
[0007]抗破伤风毒素的抗体主要分为破伤风抗毒素(Tetanus antitoxin, TAT)和破伤风 人血免疫球蛋白(Human tetanus immunoglobulin, HTIG)。目前,我国用于临床的抗破伤风 毒素的抗体绝大部分为动物抗血清(主要为马的抗破伤风毒素抗血清)。马的免疫血清,虽 然经过了剪切纯化精制,仍然保留很强的异源性,常导致过敏反应的发生,即使在皮试阴性 者注射时也会发生过敏反应。大量临床资料显示反应率为5% -30%,其中0. 001 %的过敏 反应严重者可导致死亡。有关技术人员统计了某医院自2000年1月至2002年8月120例 TAT使用者的过敏皮试情况,结果皮试阳性率为45%。
[0008]据对北京地区几家医院的TAT应用情况的调查表明,一般每家医院每天平均大约 有十几至几十人接受TAT的预防注射,几乎所有医院均不采用破伤风毒素的主动免疫预 防,而且不管患者是否经过破伤风毒素的主动免疫,均一律给予TAT注射。其注射范围也很 广,几乎所有外伤,甚至有些新鲜清洁伤口均一律注射TAT。对同一患者的反复应用也较普 遍,由此增加了过敏反应的发生率。
[0009] 从药理学角度讲,预防注射1500-3000IU的TAT,2-3天内血清抗体能保持在 0. 3-0. 6IU/ml的水平。但由于TAT是异种蛋白,在体内的半衰期短(2-14天),很快就被机 体排斥掉,十几天后其抗体水平几乎测不到,因而不利于预防作用。欧美发达国家已停止使 用马血清TAT,而采用HTIG。
[0010] 据报道,在停止使用TAT前每年接受TAT注射的人数超过300万,其中因过敏休克 病死率为1/5万一 1/20万,与受伤后不用TAT预防而患破伤风的死亡率几无差别。据我国 有关学者对几十家医院的调查来看,死于过敏的人数也与患破伤风死亡人数相近。尤其是 若有大量人群已使用过破伤风抗毒素,再次使用的可能性较大,因此产生血清过敏的风险 更大。
[0011] 破伤风人血免疫球蛋白(HITG)是从经破伤风疫苗或类毒素免疫、抗体滴度较高 的健康献血者血清中分离制备出来的,具有较好的防治效果。它属于人源性同种蛋白,较为 安全,几乎不会发生血清病与过敏反应(过敏反应率很低,仅为0.2%)。而且,该免疫球蛋 白半衰期长,可达3 - 4周,大大提升了破伤风的防治水平。在操作性方面,由于使用TAT 常发生过敏反应,所以使用前必须先做过敏试验,过敏反应阳性者,须采取脱敏注射法。注 射期间需严密观察,这对医患双方都很不方便。而HTIG则无需皮试,使用方便。
[0012] 但由于人血来源困难,供应链存在较大风险,且工业化生产复杂、易受病毒污染等 因素,使HITG的应用受到了极大地限制。相对于临床需要的上升趋势,破伤风人血免疫球 蛋白供不应求(仅满足不到1%的市场需求),价格也比普通免疫球蛋白高数倍。仅2012 年1-4月份,至少有574282瓶破伤风免疫球蛋白通过中检所及北京、四川等省(市)级药 品检验机构的审核批准上市,但正规医院仍然集体缺货。因此,目前主要还是由马血清破伤 风抗毒素这种亟待淘汰的产品占领着市场。
[0013] 近年来有一些关于发明和制备人-鼠嵌合或人源抗破伤风毒素单克隆专利和文 献。这些抗体虽能与破伤风毒素结合,但中和毒素的效价不高,且抗体的产业化生产问题尚 未解决。
[0014] 在申请号为201110106518. X国专利申请中瞿爱东等公开了两种人-鼠嵌合抗体 9B5和8C10。这些嵌合抗体是在小鼠的IgG2a抗体的基础上,用人的IgGl恒定区替换小鼠 的抗体恒定区而获得的。可是,人-鼠嵌合抗体在应用于人体时会在两周左右的时间内诱 发人体免疫系统产生抗小鼠抗体的抗抗体,因此其安全性和长期的有效性是非常值得怀疑 的。而且,根据该专利申请的记载这两种抗体的效价都不高。9B5经2. 5倍稀释后(最高有 效稀释倍数)治疗的小鼠其死亡时间处于96~120h,和对照组小鼠的死亡时间基本相同, 因此9B5的效价为1. 25IU/ml (抗体浓度为10mg/ml,即0. 125IU/mg)。同样,8C10经5倍稀 释后(最高有效稀释倍数)治疗的小鼠其死亡时间处于96~120h,和对照组小鼠的死亡时 间基本相同,因此8C10的效价为2. 5IU/ml (抗体浓度为10mg/ml,即0. 25IU/mg)。
[0015] 申请号为201010512416.3的中国专利申请中公开了另外两种人-鼠嵌合抗体 6D12 和 8D9,效价分别为 1. OIU/mg 和〈0? 25IU/mg。
[0016] 申请号为200610144981. 2的中国专利申请中公开了从人的外周血B细胞中克隆 到人源抗破伤风抗体,由此得到的抗体粗制品的效价约31IU/mg。研究者称"本试验使用的 抗体是利用含有牛血清培养液生产的,蛋白质粗制备物中含有大量的非特异免疫球蛋白。 所以本发明的人源抗破伤风毒素抗体真实的中和效价应是31IU/mg的至少若干倍,效价相 当高。"在该报道中,研究者给小鼠注射〇. 4mg/kg的抗体,能完全保护小鼠。按每只小鼠20g 计算,8yg抗体能完全保护小鼠。在本发明的实验中,500ng即0. 5yg抗体能完全保护小 鼠不死。按标准抗毒素与标准毒素混合后注射的小鼠于72~120h内全部死亡为标准,定 义抗毒素效价为〇. 5IU/ml x 0. 4ml (注射的抗体体积)即0. 2IU。
[0017] 申请号为200410070711. 2的中国专利申请中公开了采用噬菌体展示技术获得人 源抗破伤风抗体HTAT-Fab。但是,该Fab抗体是在大肠杆菌中表达,活性和产量都很成问 题。该工作没有显示任何毒素中和活性和小鼠存活的数据(所有4个图和表格都只是与 分子克隆和蛋白鉴定有关),而且在仅仅是文字描述的动物实验部分,研究者先给小鼠注射 HTAT-Fab抗体,然后再注射破伤风毒素以显示中和作用。但是这种"具有很强的中和破伤 风外毒素"的HTAT-Fab,经十多年至今未见市场化。
[0018]因此,利用先进的技术,寻找更加高效的、安全的抗破伤风类毒素单克隆抗体在本 领域中具有非常重要的意义。采用基因工程方法制备完全人源的破伤风毒素中和抗体,不 仅可解决异种蛋白的过敏问题,而且用国际产业界通用的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来大量 生产,可大大降低成本并避免血源制品的病毒污染问题。目前国际和国内抗破伤风基因工 程抗体的研究仅限于实验室阶段,尚未见到临床应用的报告。据不完全统计,国内需要TAT 和HTIG累计达1000万人份/年以上,国际需要为1. 2亿人份/年以上,市场空间广阔。
【发明内容】
[0019] 针对全人源破伤风毒素单克隆抗体的需要,本发明的主要目的在于提供一种高 效、安全的抗破伤风毒素的完全人源单克隆抗体的可变区序列及三种不同形式的重组抗 体:即含有全长的重链(H)和轻链(L)的单克隆抗体;L-P2A-H型单克隆抗体和ScFv单链 抗体。
[0020] -种全人源抗破伤风病毒单克隆抗体,所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序 列为SEQ ID N0:3所示,所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:4所示。
[0021] 在根据本发明的一个实施方案中,所述抗破伤风毒素单克隆抗体的重链的氨基酸 序列为SEQ ID N0:1所示;所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID N0:2所示;优选 地,编码所述单克隆抗体的重链的DNA序列为SEQ ID N0:5所示,编码所述单克隆抗体的轻 链的DNA序列为SEQ ID N0:6所示。
[0022] 在根据本发明的另一个实施方案中,所述单克隆抗体的重链和轻链通过自 剪切序列连接,所述自剪切序列选自2A肽段。自剪切序列2A肽段源于口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease viruses, FMDV)。所述 2A 肽段或 2A 类似肽段均由 18 ~22 个氨基酸组成,C末端序列高度保守:一 DxE xNPGP -。在核糖体翻译至该序列时,因 发生"跳跃"而实现无需蛋白酶的自动断裂(自剪切)。自剪切发生在C末端G - PS 基之间。(参阅"基于2A肽策略构建多基因表达载体的研究进展",China Biotechnolo gy, 20