071]
[0072]PBLAspn-b-PCBLLysn 1. 61g，15mLDMS0 溶解，加N，N-二异丙基乙二胺（DIP) 8mL， 于40°C搅拌下反应24h;将反应混合物在乙醚中沉淀，收集沉淀，得白色粉末，即为目标产 物PLAsp(DIP)n-b-PCBLLySni，其核磁谱图见图2A，凝胶渗透色谱图见图4A，其红外谱图见图 5b；
[0073] (8)PLAsp(DIPh-b-PLLysj^合成，反应机理及反应过程如下：
[0074]
[0075] 1. 85g(0? 25mmol)PLAsp(DIP)n-b-PCBLLysn溶解到 30mL冰醋酸中，加入 5mLHBr的 冰醋酸溶液（质量分数33 %HBr)，室温下搅拌3h，然后加入过量的无水乙醚沉淀，收集沉 淀，并用乙醚洗涤4次，蒸去乙醚，干燥；干燥后的聚合物用去离子水溶解，去离子水中透析 5天，-50°C冻干，得白色粉末，即为目标产物PLAsp(DIP)n-b-PLLySni，其核磁谱图见图2B，凝 胶渗透色谱图见图4B，其红外谱图见图5a。PLAsp(DIP)n-b-PLLySni在不同pH下的核磁谱 图见图3。
[0076] 实施例2空白囊泡和载药囊泡PAL0D0X的制备
[0077] 空白囊泡的制备：称取20mg实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP) n-b-PLLySni，用稀盐酸（1%，质量浓度）溶解，pH约为2.0,搅拌lh;20分钟内，用0.5M的 NaOH水溶液将pH值缓慢调至5. 0 ;然后20分钟内，用0. 05M的NaOH水溶液将pH值缓慢调 至6. 4 ;最后，30分钟内，用0. 001M的NaOH水溶液将pH值由6. 4缓慢调至7. 4,然后经过 450nm的滤膜过滤，最终获得空白囊泡溶液。
[0078] 载药囊泡（PAL0D0X)使用相同的方法制备：称取实施例1中的多肽嵌段聚合物 PLAsp(DIP)n-b-PLLySni 20mg和阿霉素盐酸盐2mg，用稀盐酸（1%，质量浓度）溶解，pH约 为2. 0,搅拌lh; 20分钟内，用0. 5M的NaOH水溶液将pH值缓慢调至5. 0 ;然后20分钟内， 用0. 05M的NaOH水溶液将pH值缓慢调至6. 4 ;最后，30分钟内，用0. 001M的NaOH水溶液 将pH值由6. 4缓慢调至7. 4 ;通过透析除去游离的阿霉素，然后经过450nm的滤膜过滤以 除去大的聚集体，最终得到负载阿霉素的载药囊泡（PAL0D0X)溶液。
[0079] 空白囊泡药物负载前后粒径变化图见图6A，其中Drug-free为药物负载前，对应 于空白囊泡；Drug-loaded为药物负载后，对应于载药囊泡PAL0D0X。由图6A可知：空白囊 泡的平均粒径为189nm，负载D0X后囊泡平均粒径为198nm。
[0080] 实施例3载药囊泡PALOsiRNA和联合载药囊泡PALO(DOX/siRNA)的制备
[0081] 一定量siRNA(lyg，购自广州市锐博生物科技有限公司）加入到已知量的实施 例2中的空白囊泡和载药囊泡（PAL0D0X)的溶液中，按照多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP) n-b-PLLys"^氨基与siRNA磷酸根的摩尔比为 0.5 : 1、1 : 1、L5 : 1、2 : 1、3 : 1、4 : 1、 8 : 1比例混合。用去离子水补至实验所需体积，混勾后在摇床上振荡30min，静置10min，即 得到一系列不同N/P的负载siRNA的载药囊泡PALOsiRNA溶液和联合载药囊泡PAL@(D0X/ siRNA)溶液。
[0082] 以动态光散射仪（DLS)测定实施例2载药囊泡PAL0D0X和实施例3联合载药囊泡 PAL@(D0X/siRNA)的粒径和表面电位，不同氮磷比下的联合载药囊泡PAL@(D0X/siRNA)的 粒径和电位图见图6B。由图6B可知：通过DLS测定发现，负载siRNA后，高氮磷比下囊泡 具有高的表面电位；随着氮磷比的增加，表面电位增加，平均粒径先降低后维持恒定。负载 siRNA之前，PAL0D0X的表面电位为+45. 9mV，平均粒径为198nm。氮磷比为2负载siRNA后 表面电位下降到+31. 9mV，粒径变为203nm。
[0083] 不同氮磷比下的联合载药囊泡PAL@(D0X/siRNA)的凝胶电泳图见图7,可知氮磷 比为2时，可以达到siRNA完全负载。
[0084] 实施例4酸碱滴定实验
[0085] 实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)n-b-PLLySni的缓冲能力通过酸碱滴定实 验测定。方法如下：15mg实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)n-b-PLLysm溶解于5mL 质量百分数1%的稀盐酸溶液，用IN氢氧化钠溶液滴定至溶液呈pH值为11，然后此溶液用 1. 5NHC1滴定至pH值为2,并用全自动电位滴定仪记录加酸的体积以及对应的pH值，酸碱 滴定图见图8。由图8可知：多肽嵌段聚合物在pH3.0到11. 3之间表现出明显的质子缓 冲能力，这种缓冲能力归因于多肽嵌段聚合物中共同存在的赖氨酸嵌段和叔氨基化的聚天 冬氨酸嵌段。
[0086] 实施例5载体结构的证明
[0087] 以透射电子显微镜（TEM)表征实施例2中空白囊泡的形貌，以PhihPsCM120电子 显微镜表征，激发电压为60KV。样品的制备方法如下：将10yL实施例2中的空白囊泡溶 液滴于铜网上，静置lmin后，以滤纸吸干；将铜网放在加有硅胶的干燥器中，6h后，以醋酸 铀水溶液（质量浓度为2% )对样品进行染色，静置lmin后，用滤纸吸干，将铜网置于干燥 器继续室温干燥。TEM图见图9。由图9可知：多肽囊泡为空心球状结构。
[0088] 实施例6阿霉素载药量的测定
[0089] 定义D0X在载药囊泡PAL0D0X溶液中的重量百分比为药物负载量，用 PE-Lambda750紫外-可见分光光度计检测。首先，将实施例2中的负载D0X的载药囊泡 PAL0D0X溶液冻干，称取后溶于DMS0和氯仿（V:V，1 : 1)中，紫外可见分光光度计检测 485nm处D0X的吸光度。然后，配制一系列浓度的DOXDMS0和氯仿（V:V，1 : 1)溶液，检 测485nm处的吸光度，用浓度和吸光度作出D0X吸光度的标准曲线，根据这条标准曲线算出 载药囊泡PAL0D0X中D0X的负载量为6. 4%。
[0090] 实施例7载药囊泡在不同pH值下的荧光变化
[0091] 取实施例2中的负载D0X的载药囊泡PAL0D0X溶液两份，每份2mL，将一份用pH5. 0 的PBS调节pH为5. 0。两份溶液定容至5mL，用荧光光谱仪（PerkinElmerPE-LS55,USA) 测定其荧光光谱，结果见图10A。荧光扫描的激发波长为485nm，发射波长为500-700nm，激 发狭缝及发射狭缝宽度均为511111，扫描速度为50〇11111/1^11。由图1(^可知 ：与口117.4条件下 相比，pH5. 0条件下592nm的D0X的荧光强度显著增加，表明D0X的释放量更多，聚合物囊 泡的药物释放性能具有pH敏感性。
[0092] 实施例8载药囊泡中D0X的酸敏释放行为
[0093] 用透析的方法来做D0X的体外释放实验，分别在pH7. 4的人体生理环境和pH5. 0 的酸性环境下进行体外释放研究。取实施例2中的负载D0X的载药囊泡PAL0D0X溶液两份， 一份维持其pH7. 4,将另一份调至5.0。再将每个pH值下的样品分成三份（平行实验），转 移至透析袋（MWCO= 14kDa)中，置于30mL的相同磷酸盐缓冲溶液（pH值7. 4)中。接着整 个释放实验在转速为75r/min，温度为37°C恒温空气浴摇床中进行。设定的时间点，收集透 析袋外面的缓冲液进行紫外测量并更换补齐新鲜的缓冲液。用紫外可见分光光度计检测所 取样品在波长485nm处的阿霉素的紫外吸收强度。然后，配制一系列浓度的DOX水溶液，检 测485nm处的吸光度，用浓度和吸光度作出DOX吸光度的标准曲线。根据标准曲线计算所取 样品溶液中DOX的浓度，进而计算出DOX的释放量，以时间对DOX累积释放量作图，结果见 图10B，可知：pH5.0条件下，DOX释放更快，4h内释放了大约70%的药物，24h超过80%。 然而，pH7. 4条件下，DOX的释放是非常缓慢，24h仅仅释放了 36%的DOX。pH5.0条件下， 聚合物囊泡解体，快速释放所负载的药物。
[0094] 实施例9激光共聚焦显微镜检测
[0095] 将IfepG2细胞以1X104细胞每孔接种在24孔板上，加入400yLRPMI1640培养基 (包含质量百分数10 %的胎牛血清FBS)，37°C下在5 %C02培养箱中培养24h。将实施例3中 的联合载药囊泡PALO(DOX/siRNA)溶液40yL用无血清RPMI1640培养基稀释到400yL， 加入到上述细胞培养液中孵育4h/8h。弃去旧培养基，将细胞用蓝色荧光染料DAPI染细胞 核30min，再用pH7. 4的PBS洗三次。用激光共聚焦（CLSM)观察加入实施例3中的联合载 药囊泡4h和8h绿色荧光标记的siRNA和D0X红色荧光在细胞内的分布情况。DOX、siRNA 和DAPI的激发波长，分别为485,490和358nm，发射波长分别为595, 525和455nm。联合载 药囊泡PALO(DOX/siRNA)被细胞