一种藻体中腐殖酸大孔径树脂分级方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及腐殖酸分离提取技术，具体涉及一种藻体中腐殖酸大孔径树脂分级方法。
【背景技术】
[0002]腐殖酸又名胡敏酸(humic acid)是由动植物及其残体经过复杂的物理、化学、生物过程形成的大分子有机混合物，它广泛存在于土壤、水体、沉积物等环境介质中。腐殖酸能溶于碱性和中性溶液，不溶于酸。腐殖酸中含有大量活性官能团如羧基、酚羟基、羰基、氨基和巯基，从而具有很高的反应活性。例如在天然环境中，腐殖酸能与环境中的有毒重金属离子和有机污染物(如重金属、农药、PPCPs、PAHs等)发生相互作用，形成化学和生物稳定性的溶于水和不溶于水的物质，从而改变其迀移、转化规律和生物有效性。
[0003]—般认为，腐殖酸来自于动植物残体的降解，但研究表明海洋藻体中含有大量腐殖酸。水生生物中，特别是藻体中腐殖酸的提取对研究水体中腐殖酸来源和归趋具有重要意义。现代仪器分析技术的发展，为腐殖酸的研究提供了先进的手段，取得大量突破性创新。人们已经熟知腐殖酸的含碳量、红外特征、紫外特征等基本理化性质。但是由于腐殖酸的组成和结构极其复杂，它的元素组成、分子量、芳香度及官能团含量等结构随着时空不同而发生变化。为了更近一步的研究腐殖酸的结构和组成，前人将腐殖酸进行分级分离，从而减小其异质性，取得一些列成果。但针对于藻体腐殖酸的分级分离尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种藻体中腐殖酸大孔径树脂分级方法，该方法能够克服现有技术对褐藻生物体腐殖酸分离及腐殖酸分级提取过程的不足，获得纯度较高的腐殖酸各级亚组分。
[0005]为实现上述目的，本发明公开的技术方案为:一种藻体中腐殖酸大孔径树脂分级方法，所述分级提取方法包括如下步骤:
步骤a、藻体预处理:
取风干后的藻体，剔除杂物，在3050°C下烘干，碾磨后过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取:
将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷作为提取液进行索提；索提过程中，当采用其中一种索提液索提时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提；
步骤C、藻体的氯化钙处理:
向去离子水索提藻体中加入氯化钙溶液，使固液比达到1:10，在40-70°C条件下连续搅拌10-40 min后，离心弃去上层清液，得到氯化妈处理藻体I ;
向氯化钙处理藻体I中加入氯化钙溶液，使固液比达到1:10，在40-70°C条件下连续搅拌10-40 min后，离心弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体2 ;
向氯化钙处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1:10，连续搅拌10-60 min后，离心弃去上层清液，得到去离子水处理藻体；
向去离子水处理藻体中加入盐酸，使固液比达到1:10，连续搅拌10 -60 min后，离心弃去上层清液，得到盐酸处理藻体I ;
向盐酸处理藻体I中加入盐酸，使固液比达到1: 10，连续搅拌10-60 min后，离心弃去上层清液，得到盐酸处理藻体2 ;
向盐酸处理藻体2中加入盐酸，使固液比达到1: 10，连续搅拌10 -60 min后，离心弃去上层清液，得到盐酸处理藻体3 ;
向盐酸处理藻体3中加入去离子水，使固液比达到1:10，连续搅拌10 min后，离心弃去上层清液，得到水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体的碳酸钠处理:
向水洗盐酸处理藻体中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1:10，在40-70°C条件下连续搅拌30-60 min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体I ;
向碳酸钠处理藻体I中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1:10，在40-70°C条件下连续搅拌30-60 min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体2 ;
向碳酸钠处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1:10，连续搅拌10 -60 min后，离心所得固体标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体的碱液提取:
氮气保护条件下，向水洗碳酸钠处理藻体中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使溶液中氢氧化钠和焦磷酸钠的浓度均为0.1 mol/L，且溶液中固液比为1:10，搅拌溶液4-6 h，静置20-28 h后，离心得到上层清液I和藻体残渣I ;
氮气保护条件下，向上层清液I中加入6mol/L盐酸，使溶液pH =1.0，搅拌30-60 min,静置20-28h后，离心得固体标记为腐殖酸I ;
氮气保护条件下，向藻体残渣I中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使溶液中氢氧化钠和焦磷酸钠的浓度均为0.1 mol/L，且溶液中固液比为1:10，搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心得到上层清液2和藻体残渣2 ;
氮气保护条件下，向上层清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH =1.0，搅拌30-60 min，静置20-28 h后，离心得固体标记为腐殖酸2 ;
将腐殖酸I和腐殖酸2合并，标记为粗提腐殖酸；
步骤f、藻体腐殖酸除硅:
氮气保护条件下，用含有0.lmol/L氢氧化钠和0.3 mol/L氯化钠的溶液将步骤e中的粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2 g/L，搅拌30 -60 min，高速离心分离，得到上层清液3;
将上层清液3用6 mol/L盐酸酸化至pH=l.0，再加入浓氢氟酸，使氢氟酸浓度为0.3mol/L,持续搅拌4-6 h，静置20-28h后，高速离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤g、藻体腐殖酸除富里酸:
向步骤f中的无娃腐殖酸中加入0.lmol/L盐酸溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌4_6h，并静置20-28h后，离心得到上层清液4及纯化腐殖酸；
步骤h、藻体腐殖酸的亚组分分级: 在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤g中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中的腐殖酸浓度在1-2 g/L,用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=2后，以15倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以5柱体积/h的速度，依次用pH=3、pH=5和pH=7的0.lmol/L焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，分别收集流出液并立即酸化至pH 1，搅拌4 h后，离心得到固体三份分别标记为粗提藻体腐殖酸亚组分I一一粗提藻体腐殖酸亚组分3 ;
在氮气保护下，以5柱体积/h的速度，依次用pH=9、pH= 11和pH=13的0.lmol/L焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，分别收集流出液并立即酸化至pH 1，搅拌4 h后，离心得到固体三份分别标记为粗提藻体腐殖酸亚组分4一一粗提藻体腐殖酸亚组分6 ;
步骤1、藻体腐殖酸亚组分除盐及固化:
在氮气保护下，用0.1 mol/L的氢氧化钠分别溶解粗提藻体腐殖酸亚组分I至粗提藻体腐殖酸亚组分6，用盐酸调节每份溶解液的pH=5-9，并使每份溶解液的固液比均为1:2，共计得到六份腐殖酸亚组分溶液；
将六份腐殖酸亚组分溶液分别置入6个7000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌12 h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到六份腐殖酸亚组分固体，命名为藻体腐殖酸亚组分1、藻体腐殖酸亚组分2、藻体腐殖酸亚组分3、藻体腐殖酸亚组分4、藻体腐殖酸亚组分5、藻体腐殖酸亚组分
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[0006]优选的，所述步骤g中，所得上层清液4用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上层清液4中溶解有机碳T0C>5mg/L，则重复步骤g，直到测得T0C〈5 mg/L后，再进行步骤h。
[0007]优选的，所述步骤h中，当以某一 pH值的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱时，每收集2-50 ml流出液，即用特定波长紫外/可见波长进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止该pH值的焦磷酸钠缓冲液的淋洗。优选的，步骤h中，用550η波长的紫外/可见波长进行测定流出液的吸光值。
[0008]优选的，所述步骤i中，每个透析袋的透析体系搅拌12h后，先用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤i中去离子水中总磷的含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01 mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌12 h后，再次测定，直到测得的总磷含量〈0.01 mg/L且检测不到氯离子。
[0009]优选的，还包括步骤j:取少量步骤i所得的六