一种绿色木霉菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物技术领域，具体设及一种绿色木霉菌菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 根结线虫（Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。已知危害蔬 菜的线虫主要有花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫W及甜菜根结 线虫等。线虫寄主范围广泛，常危害瓜类、茄果类、豆类及萝K葫萝K窝宦、白菜等30多 种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害。根结线虫是一种重要的农作物病原物，每年造成 大约数十亿的损失。根结线虫主要侵染农作物的根部，侵染后的根部膨大形成巨大的根结， 可互连接形成串珠状，由于根部被破坏，影响正常的吸收机能，所W地上部生长发育受阻， 被侵染后的植株地上部表现矮化，叶部黄化，结果小而且少。天气干燥时易萎黨或枯萎。长 期连作的溫室中，特别是西甜瓜、黄瓜、番茄等作物上甚至造成绝产。
[0003] 由于抗根结线虫病的种质资源稀少，所W在生产中化学防治仍然是防治根结线虫 的重要措施，如棉隆、氯化苦和百亩威等，运些药剂虽然杀虫快，但是会严重降低蔬菜质量， 污染环境，破坏生态平衡，使用过程中对人、畜不安全，因此生物防治措施日益受到人们的 关注。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术中化学防治存在的污染环境、不安全的问题， 提供一种绿色木霉菌菌株及其应用。 阳0化]为实现上述目的，本发明提供了一种绿色木霉菌菌株，其微生物保藏编号为CGMCC NO. 10922 ;分类命名是：Trichodermavirens;保藏时间：2015年5月27日；保藏地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC)。
[0006] 本发明还提供了绿色木霉菌菌株制备的生防种衣剂。
[0007] 本发明还提供了绿色木霉菌菌株制备的生防种衣剂在防治根结线虫中的应用。
[0008] 优选的，所述根结线虫为南方根结线虫和/或北方根结线虫。
[0009] 本发明还提供了绿色木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，该方法包括W下步 骤：
[0010] (1)将绿色木霉菌菌株Tvir-6接种于PDB培养基中振荡培养，获得抱子浓度为 l〇7-l〇i〇/ml的抱子悬浮液；
[0011] (2)将步骤（1)的抱子悬浮液1-化与娃藻± 500-700g、玉米粉200-400g、麦教 50-150g混合均匀后，进行固体发酵，得到固体发酵物；
[0012] (3)将步骤（2)的固体发酵物粉碎，过60目筛，得到抱子粉，抱子粉与粘着剂、分散 剂、防腐剂混合后，制备得到生防种衣剂。
[0013] 优选的，步骤（1)中PDB培养基配方为：马铃馨200g/l，葡萄糖20g/l，余量为水。
[0014] 优选的，步骤（I)中培养条件为25-28°C，振荡培养6-8天。
[0015] 优选的，步骤（2)中，在28-30°C条件下进行固体发酵，发酵6-8天后，于室溫条件 下干燥3-5天，得到固体发酵物。
[0016] 优选的，步骤（3)中，抱子粉、粘着剂、分散剂、防腐剂的质量比为85-90 :1-3 : 8-10 :1-2O
[0017] 优选的，步骤（3)中，粘着剂为簇甲基纤维素钢，分散剂为木质素横酸钢，防腐剂 为链霉素。
[0018] 本发明的有益效果为：
[0019] (1)绿色木霉菌Tvir-6菌株为从±壤中分离到的真菌，对作物安全无害，且对根 结线虫具有防治作用，在应用中具有安全性，适合用于根结线虫的生物防治。
[0020] (2)使用方法简单实用：将绿色木霉菌菌株制成生防种衣剂，对种子进行丸化包 衣，工艺简单实用。
[0021] (3)防治效果高且稳定：绿色木霉菌Tvir-6菌株发酵液对根结线虫二龄幼虫的致 死率达到99 %W上，在溫室中的防治效果达到79. 5 %，防治效果高且稳定，适于农业生产 需求。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的绿色木霉菌菌株Tvir-6的细胞形态图；
[0023] 图2为本发明的绿色木霉菌菌株Tvir-6的菌落形态图；
[0024] 图3为本发明的绿色木霉菌菌株Tvir-6的ITS和TEF片段PCR扩增结果图。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。 阳0%] 实施例1
[0027] 绿色木霉菌的分离、纯化及鉴定： 阳02引从顺义番茄种植田块中均匀取±壤样品，每IOg±壤分别与100mL灭菌水进行混 合制成悬浮液，然后依次进行梯度稀释，取稀释10000倍的±壤混液100y1涂布于PDA培 养基平板上（即马铃馨200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馈水定容至1000ml。将此培养基在 12rC灭菌，在培养皿中铺制成平板）。PDA培养基中含有75yg/ml氨节青霉素，抑制细菌 生长。将培养基置于25°C培养，待组织块长出菌落后，进行单抱分离，挑取单菌落在PDA培 养基上纯化，用于分类鉴定。根据《真菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。
[0029] 挑取菌落上菌丝，放入盛有300y1真菌裂解液FPCB的EP管中，65°C裂解2小时， 然后用真菌基因组DNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司）提取真菌DNA，WDNA为模 板，用引物口SUITS4和EF1H、邸2T分别进行ITS和ten序列扩增。PCR扩增反应体系为 20^1，含有IOylPCRMasterMix，lyl正向引物，Iyl反向引物 2,2ylDNA模板，hq 酶0.5^1，无菌水5.5^1。扩增条件：941：4111111，941：553,551：303,721：503,30个循环； 72°C7min。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。
[0030] 结果：参见附图1-2,获得Tvir-6菌株在PDA培养基平板上，25°C，培养3天后，菌 落直径为40-60mm，菌落绿色。菌丝分隔，透明，表面光滑，气生菌丝少，直径为1-7ym。在主 分枝底部着生许多粗短的次级分枝。分生抱子梗对生或互生呈树枝状分枝，顶端小梗呈瓶 形，小梗顶端生分生抱子团，分生抱子梗主轴上部弯曲。分生抱子梗长度可达60ym，基部 宽5ym，尖端下部产生1-2个轮生瓶状抱子梗，抱子梗长6. 8-13. 2ym，最宽为2. 5-3. 5ym， 基部为2. 0-3. 0ym。分生抱子多为楠球形，呈淡绿色，大小为2. 5-4. 5X2-4ym。依照《真 菌鉴定手册》对Tvir-G菌株形态进行测定，确定该菌株绿色木霉菌（Trichodermavirens)。
[0031] 用引物口SUITS4和EF1H、邸2T分别进行ITS和ten序列扩增，PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像参见附图3所示。经测序分析菌株扩增的ITS和ten序列长约 为570bp和88化P。将菌株的ITS和ten序列进行BLAST分析后，结果显示，Tvir-6菌株 与绿色木霉菌（Trichodermavirens)相似度达到了 100%。鉴定Tvir-G菌株为绿色木霉 菌（Trichodermavirens)。 阳0巧实施例2
[0033] 绿色木霉菌种衣剂的制备及应用：
[0034] 将Tvir-6菌株分别接种到250ml的S角瓶中，每瓶含有PDB液体培养基125ml，在 25°C中震荡（ieOrpm)培养8天，得到大量的菌丝体和分生抱子。液体发酵培养基为马铃馨 葡萄糖液体（PDB)培养基，即马铃馨200g，葡萄糖20g，蒸馈水定容至1000ml。
[0035] 将液体摇菌培养（发酵）所得的抱子菌丝体混合液，抱子浓度为IO7个/ml)，加 入W下成分：比例如下：抱子液1L、娃藻± 500g、玉米粉200g、麦教50g，混合均匀后，置于 28°C条件下进行固体二次发酵，发酵6d结束后，将固体发酵物放在室溫条件下自然干燥 3d(发酵物含水量控制在15-25%之间）、粉碎、过60目筛，得到抱子粉。将抱子粉与粘着剂 (簇甲基纤维素钢）、分散剂（木质素横酸钢）、防腐剂（链霉素）混合，制备得到生防种衣 剂，其中，抱子粉、粘着剂、分散剂、防腐剂的质量比为85 :3 :10 :2,然后种衣剂与种子揽拌 均匀，使抱子粉均匀包衣在种子表面，即完成生防种衣剂对黄瓜种子的丸化包衣处理，种衣 剂与种子的重量比为1:10 (w/w)。
[0036] 实施例3 阳037] 绿色木霉菌种衣剂的制备及应用：
[0038] 将Tvir-6菌株分别接种到250ml的S角瓶中，每瓶含有PDB液体培养基125ml，在 28°C中震荡（ieOrpm)培养6天，得到大量的菌丝体和分生抱子。液体发酵培养基为马铃 馨葡萄糖液体（PDB)培养基，即马铃馨200g，葡萄糖20g，蒸馈水定容至1000ml。
[0039] 将液