次生盐渍化土壤修复菌剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种土壤微生物技术领域的修复技术，具体是一种设施蔬菜次生盐渍化土壤修复菌剂的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]由于农业生产中长期施用化肥，尤其是氮肥，超过了植物的需求并在植物体内及土壤中累积，以及不合理的土壤管理等导致的土壤次生盐渍化问题是我国农业生产面临的困境。一方面，土壤次生盐渍化会导致土壤表层硝酸盐的积累，影响作物生长与产量；另一方面，长期施用氮肥不仅会造成肥料的浪费，还会通过地表径流和农田渗漏导致农业面源污染；最后，植物体内的硝酸盐进入人体，严重致人死亡，还会合成致癌化合物影响人类健康。目前用于修复次生盐渍化土壤主要有轮茬换作的种植制度优化、用暗管排水的水利措施、应用土壤改良剂的化学措施。这些措施虽然有一定的优点，但是存在很大方面的不足，轮茬换作周期长，见效慢；暗管排水施工复杂不方便，投入高；土壤改良剂成本高，有可能产生二次污染。微生物法修复次生盐渍化土壤具有成本低、操作方便、不产生二次污染等优点。我国大面积的次生盐渍化问题日益突出，微生物法处理硝态氮的研究具有广阔的前景，但在目前微生物修复次生盐渍化土壤的过程中，存在的主要问题是:菌剂没有合适的剂型可以缩小体积并长距离运输，严重限制了微生物修复机数在修复次生盐渍化土壤中的应用。
[0003]微生物菌剂是将目标微生物扩繁后，加入载体、助剂、保护剂等加工后获得的活菌制剂。经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103203356A，公开日2013.07.17，公开了一种次生盐渍化土壤微生物菌剂及其制备、用途。所述的次生盐渍化土壤微生物菌剂由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT -2CGMCC N0.4698和载体组成，所述的载体为稻麦稻杆和葡萄糖。制备时，每升巨大芽孢杆菌菌液中加入0.5?0.6kg稻麦稻杆，0.3?0.4kg的葡萄糖，混合均匀，即得所述的次生盐渍化土壤微生物菌剂；每毫升所述的巨大芽孢杆菌液的含菌量为2.0X 108?2.32X 108个。但该技术所制得的菌剂体积大，不方便携带，运输成本高；所制得的菌剂活菌数不高；菌剂中营养成分少，生物菌剂的效果受到限制。
[0004]中国专利文献号CN103525739A，公开(公告)日2014.01.22，公开了一种土壤修复技术领域的硝酸盐同化细菌及其在修复设施次生盐渍化土壤中的应用，通过硝酸盐同化细菌NCT - 2以土壤中硝态氮作为氮源，并将其同化为其它形态的无机氮或细胞组分，从而实现对硝态氮的降解转化、降低土壤中硝态氮含量并对土壤进行修复。该硝酸盐同化细菌NCT - 2为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，该硝酸盐同化细菌NCT - 2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.4698。但该技术并未将菌液做成体积相对较小的剂型，应用时体积大不方便；运输成本相应增加；并未对最终菌体存活率及存活数量进行测定，很难保证施用时有效性。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种次生盐渍化土壤修复菌剂的制备方法及应用，采用单因子试验、响应面实验对保护剂进行筛选，复配后与发酵液混合后进行冻干，不仅操作、储存方便，还减少了成品体积，降低了运输成本。所得菌剂活菌数高，营养丰富，便于后期使用。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明涉及一种次生盐渍化土壤修复菌剂，含有冻干后的巨大芽孢杆菌菌株发酵液及保护剂，其中:巨大芽孢杆菌不仅可以降低土壤硝态氮的含量和EC值，并且可以增加土壤中有机质的含量，提尚疏采广量和品质。
[0008]所述的巨大芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，长杆状，需氧、运动。可还原硝酸盐和亚硝酸盐。在无生长因素的情况下，能以铵盐、硝酸盐、葡萄糖为唯一的碳源增值。
[0009]所述的巨大芽孢杆菌具体为:Bacillus megaterium NCT-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC N0.4698，保藏日期为2011年3月21曰。
[0010]所述的保护剂采用蔗糖、甘露醇、Twen 80、甘油、脱脂奶粉、山梨醇、淀粉、L -谷氨酸钠、麦芽糊精、葡萄糖、海藻糖中的任意一种或几种的组合。
[0011]本发明涉及上述土壤修复菌剂的制备方法，包括以下步骤:
[0012]步骤1、菌种复苏与活化:将NCT - 2接种到LB固体培养基中复苏处理后，接入到无机盐培养基中，28°C?35°C培养16h?20h，得到液体发酵种子培养液；
[0013]所述的无机盐培养基的组分及质量百分比含量为:氯化钾0.1%?1%，七水合硫酸镁0.01 %?0.7 %，磷酸二氢钾0.01 %?2 %，硝酸钾0.1 %?3 %，蛋白胨0.1 %?
2.7%，葡萄糖0.1%?3.2%其余为含微量铁和钙的成分，pH7.0?7.2。
[0014]步骤2、菌种发酵:将液体发酵种子培养液按1%?5%的接种量接入发酵罐，在28°C?35°C的环境下培养16h?24h，得到修复设施蔬菜土壤次生盐渍化菌的发酵液。
[0015]步骤3、向步骤2中得到的发酵液中加入保护剂，振荡使其混匀制得菌体悬浮液。
[0016]所述的保护剂采用蔗糖、甘露醇、Twen 80、甘油、脱脂奶粉、山梨醇、淀粉、L一谷氨酸钠、麦芽糊精、葡萄糖、海藻糖中的任意一种或几种的组合，该保护剂的浓度为菌体悬浮液，即总质量的0.1%?8.2% (wt)。
[0017]步骤4、将菌体悬浮液进行真空冷冻干燥12h?24h得到冻干菌剂。
[0018]所述的冻干条件为:冻干厚度5nm?10臟，冷阱温度为-20°C?-40°C，压力舱1Pa ?30Pao
[0019]所述的冻干菌剂中菌体存活数为19?10 12cfu/mL。
[0020]本发明涉及上述土壤修复菌剂的应用，具体为将该土壤修复菌剂用于修复设施蔬菜次生盐渍化土壤。
[0021]所述的修复，具体为:将上述土壤修复菌剂按1:100?1:500的体积比加入水，以2000mL/亩的比例滴灌于待修复的土壤中，每毫升所述的巨大芽孢杆菌稀释液含菌量为
2.0XlO8- 4.5 X 10 8个。
[0022]所述的待修复的土壤无需经任何预处理。
[0023]所述的蔬菜绿叶蔬菜类、根菜类及果菜类蔬菜。
[0024]所述的次生盐碱化土壤中硝态氮含量大于0.7g/kgo 技术效果
[0025]与现有技术相比，本发明技术效果包括:
[0026]1、本发明菌液在冻干后活菌数满足国家标准；体积大大减少，携带方便，便于运输；营养成分丰富，有利于后期施用，施用效果好。
[0027]2、本发明用微生物菌剂手段对次生盐渍化土壤进行修复，修复效果好，可以显著降低土壤中硝态氮含量，降低土壤EC值，提高有机质含量，促进微生物多样性，减少氧化亚氮气体排放，并有利于提高作物产量。
【附图说明】
[0028]图1为实施例效果示意图。
【具体实施方式】
[0029]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
[0030]设施蔬菜次生盐渍化土壤修复菌剂的制备:
[0031]菌种复苏:从-80°C冰箱中取出巨大芽孢杆菌菌株NCT - 2，划线接种到LB固体培养基上，35 °C培养24h。