一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一株产阿魏酸醋酶的隧淀粉乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 隧淀粉乳杆菌是一种具有淀粉水解活性的乳酸细菌，其产生的解淀粉酶具有淀粉 酶和支链淀粉酶的双重活性，因此隧淀粉乳杆菌可W直接转化复杂的淀粉质底物生成乳 酸。目前从自然环境中分离筛选出利用淀粉为碳源生产乳酸的隧淀粉乳杆菌成为乳酸发酵 研究领域的一个热点。
[0003] 阿魏酸醋酶是一类能够降解植物细胞壁中阿魏酸与木质素或阿拉伯半糖相交联 的醋键的水解酶。阿魏酸醋酶同其它纤维素酶如木聚糖酶、阿拉伯糖巧酶等具有协同作用， 共同作用于植物细胞壁时，能提高细胞壁的降解效率。利用阿魏酸醋酶，可W降低生产工艺 中采用化学法所带来的环境污染问题。同时，阿魏酸醋酶水解细胞壁释放的阿魏酸是一种 天然的抗氧化剂，可W清除细胞内的自由基。鉴于阿魏酸醋酶的上述优点，它在造纸、纺织、 食品、化妆品、医药等行业具有广泛应用。
[0004]目前阿魏酸醋酶主要来源于微生物，不同微生物所产生的阿魏酸醋酶各具特性， 它们在编码序列、氨基酸结构、物理化学性质和及催化特性上都有所差异。已报道的菌株其 阿魏酸醋酶的产量均较低，无法满足工业化生产。因而筛选获得新的阿魏酸醋酶产生菌株 仍有很大的必要性。
[0005] 饲料青胆技术的研究及应用已有上百年的历史。青胆饲料是将含水率为65%-75%的青绿賴杆切碎后，在密闭绝氧的条件下，通过乳酸菌的厌氧发酵作用，抑制各种杂菌 的繁殖，而得到的一种粗饲料。青胆饲料气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长 期保存，是家畜优良饲料来源。青胆饲料对草食动物，尤其是对奶牛已成为不可缺少的常规 饲料。目前在青胆过程中，除乳酸菌外还会添加淀粉酶和纤维素酶等青胆酶制剂。淀粉酶 可W降解賴杆中的淀粉，为微生物的生长繁殖提供可溶性碳源，并且代谢产生的乳酸可W 对其它微生物起到抑制作用。鉴于阿魏酸醋酶降解植物细胞壁中交联的阿魏酸基团后，更 有利于其它纤维素酶作用的发挥，相互协同下提高对賴杆的利用率，开发或筛选具有淀粉 酶和阿魏酸醋酶产生能力的乳杆菌，在降解淀粉的同时增强纤维素的水解能力，W满足对 青胆饲料发酵的要求成为目前研究课题的热点。
【发明内容】
[0006] 针对传统发酵青胆饲料菌株特性不足，本发明要解决的问题是提供一株产阿魏酸 醋酶的隧淀粉乳杆菌及其应用。
[0007] 本发明所述的产阿魏酸醋酶的隧淀粉乳杆菌，其特征在于：所述菌株命名为隧淀 粉乳杆菌化actobacillusamylovorus)。，该菌株已于2015年7月6日保藏于"中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、"，其保藏编号为CGMCCNo.11056。
[0008] 上述隧淀粉乳杆菌化actobacillusamylovorus)C分离自山东青胆发酵玉米 饲料中，是一株能够产生阿魏酸醋酶的瞻淀粉乳杆菌，具有瞻淀粉乳杆菌的典型特征，即 为：革兰氏阳性、兼性厌氧，无芽抱，不运动；菌藩较小且大小均一，边缘整齐，乳白色；细胞 呈长杆状，单个出现或呈短链，1.OUmX3. 0-5.OUm;上述日篮淀粉乳杆菌（Xactobacillus amylovorus)c的生理生化特征详见表Io
[0009] 表1 :上述日篮淀粉乳杆菌（Xactobacillusamylovorus)C的生理生化特征
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[0011] CN105154371A 说明书 4/7 页
[0012] 上述隧淀粉乳杆菌（Xactobacillus amylovorus)CCGMCCNo.11056 生长溫度为 25-42°C，最适生长溫度为37°C。
[0013] 上述隧淀粉乳杆菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 在MRS培养 基中生长，静置培养12小时后，菌体密度达到5. 74,抑值为4. 12。
[0014] 上述MRS培养基的配方：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，葡萄糖20.Og, 巧樣酸S锭2.Og,硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸钢3. 12g，憐酸氨二钢1. 63g，乙酸钟 2. 25g，吐溫-801. 0血，蒸馈水1000血，固体需加琼脂20.Og, 115°C灭菌30分钟。
[0015] 上述隧淀粉乳杆菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 在含淀粉培 养基固体平板中37°C静置培养48小时，形成的淀粉水解圈如图1所示；在含淀粉培养基液 体试管中37°C静置培养48小时，菌体密度可达到6. 26,抑值降至3. 92,上清液处理淀粉2 小时后还原糖含量达到0. 6mg/血。
[0016] 上述含淀粉培养基配方为：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，可溶性淀粉 10.Og,巧樣酸S锭2.Og,硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸钢3. 12g，憐酸氨二钢1. 63g，乙 酸钟2. 25g，吐溫-801. 0血，蒸馈水1000血，固体需加琼脂20.Og, 115°C灭菌30分钟。
[0017] 上述隧淀粉乳杆菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 在含阿魏酸 乙醋培养基固体平板中37°C静置培养72小时，菌株产阿魏酸醋酶水解阿魏酸乙醋形成的 透明圈如图2所示；在含阿魏酸乙醋培养基液体试管中37°C静置培养72小时，检测阿魏酸 醋酶酶活到达420mU每毫克蛋白。
[0018] 上述含阿魏酸乙醋培养基配方为：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，10% (W/V)阿魏酸乙醋的DMSO溶液15血，巧樣酸S锭2.Og，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸 钢3. 12g，憐酸氨二钢1. 63g，乙酸钟2. 25g，吐溫-801. 0血，蒸馈水1000血，固体需加琼脂 20. 0g，115°C灭菌 30 分钟。
[0019] 将本发明的隧淀粉乳杆菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 1105616S rDNA基因序列与有关菌株的16SrDNA基因序列比较，虽有相似性，但却不完全相同，说明 本发明的菌株是首次分离鉴定，具有原创性。
[0020] 本发明所述产阿魏酸醋酶的隧淀粉乳杆菌在制备发酵青胆饲料中的应用。
[0021] 其中：所述产阿魏酸醋酶的隧淀粉乳杆菌在含淀粉培养基中生长能产生淀粉酶， 在含阿魏酸乙醋培养基中生长能产生阿魏酸醋酶，将其按每千克物料为1.OXIO6C化的菌 数接种量混合于青绿賴杆物料中，常溫密闭发酵45天或W上，即获得每千克干物质乳酸含 量20. 49gW上的青胆饲料。
[0022] 优选的实施方式是：所述青绿賴杆物料是长度为2 + 0. 2cm的青绿玉米賴杆。
[0023] 本发明公开了一株产阿魏酸醋酶的隧淀粉乳杆菌，实验证实，所述隧淀粉乳杆菌 (Lactobacillus amylovo;rus)cCGMCCNo.11056 可[^水解淀粉，并可W产生阿魏酸醋酶， 预示该菌株在造纸、纺织、食品、化妆品、医药行业有潜在的应用价值，特别是其发酵青胆饲 料可W提高乳酸含量8%，降低抑值0. 27,缩短发酵周期15天，在制备发酵青胆饲料和其 它微生态制剂中具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0024] 本发明所述隧淀粉乳杆菌（Xactobacillusamylovorus)C菌株已于2015年7月 6日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号）"，其保藏编号为CGMCCNo. 11056。
[00巧]图 1 :隧淀粉乳杆菌(Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 水解淀粉产 生透明圈。
[0026] 图 2 :隧淀粉乳杆菌(Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 水解阿魏酸 乙醋产生透明圈。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1 :隧淀粉乳杆菌化actobacillus amylovorus) C菌株的筛选及生理生化 特性鉴定
[0028] 将山东青胆发酵玉米饲料样品用无菌水洗涂并适度稀释后涂布在MRS培养基琼 脂平板上，37°C培养24小时，挑取白色圆形且过氧化氨酶阴性的菌落，镜检为长杆菌，反复 划线确定纯菌落，接种到MRS培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定，最终筛选得 到一株隧淀粉乳杆菌，该菌株命名为隧淀粉乳杆菌化actobacillusamylovorus)C。
[0029] 上述隧淀粉