一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞的应用领域，具体为一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别 细胞制备方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞：间充质干细胞（mesenehymalstemcell,MSC)是来源于早期中胚 层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在不同的诱导条件下，可分化为造 血细胞W外的多种组织细胞，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞 和星形胶质细胞等。近年研究表明，MSC除支持体外造血、促进体内造血重建外，还具有抑 制同种异体免疫反应，降低移植物抗宿主病（GV皿）的作用。
[0003] 人厮带间充质干细胞化UCMSC):人厮带连接于母体和胎儿之间，妊娠期间为 胎儿提供营养，由=部分构成：羊膜被覆上皮、厮血管和位于两者之间被称为华通氏胶 (Wharton'SJelly)的黏液结缔组织。华通氏胶对厮血管起支撑和保护作用华通氏胶中存 在着一种成纤维样细胞，该细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能，被称为人厮带间充质 于细胞化UCMSC)。
[0004] Toll样受体（TLRs):在机体的先天性免疫和获得性免疫中作为重要的调节器对 病原体的识别发挥着非常重要的作用。化Rs作为一类病原模式识别受体，TLRs信号失调会 引起多种疾病。TLRs存在于多数骨髓细胞（如巨隧细胞、树状突细胞、中性细胞、T细胞、B细 胞）及非骨髓细胞（如上皮细胞和纤维细胞）中，迄今为止已发现有10种人化Rs(TLRl~ 10)。 阳〇化]混合淋己细胞培养（MLC):常用于器官移植前的组织配型，W测定受体和供体主 要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋己细胞接受同种异型抗原的刺 激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因 此又是免疫调节研究中常用的实验模型。
[0006] 免疫调节：是指免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间，W及与其它系统如神经 内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答W最恰当的形式维持在最适当的水平。免疫调 节配合好可W识别和清除抗原，对自身成分产生免疫耐受，维持内环境的稳定。配合差会导 致病原微生物感染、肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷病、超敏反应。
[0007] 干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可W分为胚胎干细 胞和成体干细胞。其中间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有高度自 我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在体外可W分化诱导为骨、脂肪、神经等多种组织细 胞，具有向受损组织归巢并且修复、重建受损或病变组织器官的特点。此外，MSCs还具备免 疫原性低、移植成活率高、细胞治疗效果好等特点，因此成为当前干细胞研究的热点。
[0008] 根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会制定的最低标准，MSCs需满足W下条件：1)15〔3在标准培养条件下呈贴壁生长；2)15〔3表达〔0105，〔073和〔090，不表达 CD45,CD34,CD14或CDllb,CD79a或CD19和HLA-DR;3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、月旨 肪细胞和软骨细胞分化。
[0009]目前临床应用MSCs的主要来源为骨髓、厮带血，但成人骨髓中MSCs数量较少，病 毒感染率高，免疫原性强，且取材较复杂，限制其应用。近年研究显示，人厮带中存在大量的 MSCs,与其他来源相比，厮带间充质干细胞化UCMSC)更加易于获得，对母子均无损伤，且冻 存和复苏后细胞的生物学性状无明显变化，使其成为细胞治疗中的理想细胞而逐渐替代骨 髓来源MSCs。
[0010] MSCs除具有支持体外造血、促进体内造血重建、组织损伤修复外，还具有独特的免 疫调节作用，而其调节作用又WT细胞为主，在混合淋己细胞反应中，通过周期阻滞抑制T 细胞增殖，但不引起T细胞调亡增加、活化受抑。同时MSCs还能降低反应体系中的CD8T细 胞和Thl细胞，由Thl极化状态向化2漂移，升高化2细胞，其分泌的IL-4,比-10等细胞因 子含量明显增加，从而抑制炎症反应，在T细胞介导的自身免疫性疾病中发挥治疗作用。 W11] 实验表明，MSCs在体外可抑制T细胞分泌IFN-丫，促进IL-IO的分泌，Treg细胞 比例增加；NK细胞IFN-丫分泌减少。运一切表明，MSC存在于炎症环境中，通过改变DC1、 DC2、Thl、Th2或化eg等分泌细胞因子调节免疫反应，最终使炎症环境向抗炎性环境转变。
[0012] 免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但 是，免疫抑制剂的副作用严重，包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等。MSCs的免疫 调节及免疫逃避等功能，被广泛地用来治疗由于器官移植造成的移植物抗宿主病（GV皿） 和自身免疫性疾病。在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病初期，经静脉输注MSCs可诱导外周 淋己器官对T细胞耐受而改善病情。用II型胶原免疫接种小鼠的同时，经腹腔内注入同种 异体MSCs能有效避免小鼠关节内骨与软骨的破坏；在造模成功小鼠已经出现类风湿关节 炎症状之后，再输注MSCs同样能阻止关节的严重破坏。此外，向多发性硬化患者体内输注 WJCMSC，可控制病情。
[0013] 运些研究说明，WJCMSC在体内、外对T淋己细胞具有负调节作用，兼有免疫抑制能 力及诱导免疫耐受的特性，MSCs有可能作为治疗GV皿和自身免疫性疾病的新方法。因此， 寻找一种能有效增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备的方法，是更好地发挥MSCs 疗效的关键。
[0014] 现有技术中MSCs的制备方法为：
[0015] (1)、将采集的厮带消毒后，用PBS洗去残留的血液，分离并去除血管组织，剪碎厮 带组织至l-3mm3大小，放入T75培养瓶底部，间隔0. 5-1. 0cm。将培养瓶置于37°C、5%C02 培养箱中解育，于第二天添加完全培养基，含有10%胎牛血清（FB巧的低糖DMEM培养基，W 后隔天观察细胞，当细胞达到80-90%融合度时，将细胞消化传代。此为PO代细胞；
[0016] 似、细胞传代
[0017] 应用0.25%膜蛋白酶消化5-lOmin，待细胞和残余组织块悬浮后，用2倍体积的完 全培养基终止消化。W1500巧m/min离屯、lOmin，弃去上清。用完全培养基重悬细胞，调整 密度为1~5Xl〇5/mU接种在T75培养瓶中培养。此为Pl代细胞。
[0018] (3)、待Pl代细胞到达80-90%融合度时，按照上述方法进行消化传代，命名为P2 代细胞，W此类推。
[0019] (4)、选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定。
[0020] 巧）、选取P4或者P5代细胞进行治疗。
[0021] 现有技术存在的缺点：
[0022] 现有技术使用含有胎牛血清的培养基，人体可能会产生针对异种蛋白的过敏反 应；应用组织块培养方法，在进行第一次消化传代时，残余的组织块被废弃，损失了大量的 间充质细胞，造成产量的降低；通过现有技术中产生的MSCs,虽然具有一定免疫调节能力， 但是调节能力受限，需要大量输注才能满足临床治疗的需要。而大量外源性异体细胞的输 注会造成明显的生物制品输注反应，因此细胞输注数量受限，降低MSCs的免疫调节疗效。
【发明内容】
[0023] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术中使用含有胎牛血清的培养基，应用组 织块培养的方法造成产量低、免疫调节能力有限的缺陷，提供一种增强MSC免疫调节功能 的临床级别细胞制备方法。
[0024] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[00巧]一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，包括W下几个步骤： [00%] -、厮带采集和间充质干细胞分离培养
[0027] (1)、取正常足月产健康新生儿厮带10~15cm，立即放入加有10~20%质量分数 的双抗溶液的DMEM培养基中；厮带需要在在8-12h内处理完毕；
[0028] (2)、超净台内取出厮带，用75%酒精消毒厮带表面，用生理盐水充分洗涂残留的 血液；将厮带剪成1~2cm小段，再次漂洗；剖开厮带，提出厮静脉和厮动脉，将剩余的华通 氏胶厮带组织剪成1~2mm3大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0. 5~1.Ocm,将培养瓶置 于37°C、5%体积浓度的C02培养箱中