ellll-120的具有SeqIDNo. 1和SeqIDNo. 2所示 序列的上下游引物。
[0072] 所述试剂盒还包括用于PCR反应和/或电泳的常规试剂。具体地，所述用于PCR 反应的常规试剂包括：dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反应缓冲液、标准阳性模板、双蒸水 等，也可W是常见的可商购获得的PCR试剂盒、PCR反应Mix等等；所述电泳的常规试剂包 括：TE缓冲液、聚丙締酷胺、琼脂糖、四甲基乙二胺、甲醒、硝酸银等。
[0073] 实施例3、本发明所述Indel标记或试剂盒的验证与应用
[0074] 1. 1本发明所述Indel标记或试剂盒在筛选含基因erl-7的杂交后代中的有效性 验证及筛选应用 阳0巧]用实施例1获得的Indel标记InDellll-120或实施例2获得的试剂盒进行群体 验证，用于鉴定感病品种巧魏6号巧rl)与抗病品种G0003967杂交衍生的Fi、F2群体的每 个单株的基因型。InDellll-120在所有Fi植株中都扩增出两条目的条带，分别为183bp 和193bp。InDellll-120在Fz群体单株材料中的扩增结果出现=种情况：纯合抗病基因型 (183bp)，纯合感病基因型（193bp)和杂合基因型（183bp，193bp)3种带型，且S种带型与Fz 群体的性状表现型一一对应。显示出的运=种基因型分别对应纯合抗病，纯合感病和抗感 分离的株系（图I)。标记InDel111-120在Fz群体中的分离模式通过X2检验，符合1:2:1比 例，表明InDellll-120为共显性标记。并且PCR扩增出的3种带型与Fs的每一个株系的表 型--对应，运表明InDellll-120是与抗病基因e;rl-7共分离的功能标记。通过mapmaker 3. 0软件计算遗传连锁距离，使用Map化aw构建遗传连锁图谱。InDellll-120与抗病基因erl-7的遗传距离为OcM,证明标记InDellll-120为与erl-7共分离的功能标记。
[0076] 可W采用本发明所述Indel标记InDellll-120或试剂盒在感病品种巧魏6号 巧rl)X抗病品种G0003967的杂交后代进行含基因erl-7的单株筛选，即，在各魏豆单株 的生长早期，如，幼苗期，对各单株进行基因组DNA提取，采取实施例1的检测步骤进行PCR 扩增和电泳，并根据电泳结果，筛选出与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征 条带（183bp，序列如SeqIDNo.3所示）一致的材料，即可尽早地筛选出包含抗白粉病基因 er1-7的杂交单株材料。
[0077] 1. 2本发明所述Indel标记或试剂盒在筛选其它遗传背景魏豆资源中的应用
[0078] 将实施例1获得的Indel标记InDellll-120或实施例2获得的试剂盒在魏豆品 种资源上进行应用和功能验证。PCR扩增和电泳检测按照实施例1中描述的检测步骤进 行，最后根据电泳结果筛选出与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带 (183bp，序列如SeqIDNo. 3所示）一致的材料。结果如图2所示，所述标记InDel111-120 在所有含有抗病等位基因erl-7的魏豆资源上（G0003936，G0003958，G0004394，G0003895， G0003899，G0003931经过PsMLOlcDNA序列鉴定，均在111-120处缺失IObp)，均扩增出一条 183bp的目的条带。在感病资源（巧魏6号，晚魏1号）和含有抗病基因erl其它等位基 因erl-UTara)，erl-2狂9002)，erl-4(YI)，erl-6(G0001778)上均扩增出一条大IObp的 193bp的片段。InDellll-120能够成功区分含抗病基因erl-7的魏豆资源。此结果验证了 功能标记InDellll-120在魏豆资源鉴定中的有效性。
[0079] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了比较详细的阐述， 但在发明基础上，可W对其做一些修改和改进，运对本领域技术人员而言是显而易见。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 与豌豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记，其特征在于，用于扩增所述Indel 标记的引物具有如下核苷酸序列： InDel111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG； InDel111-120-R ：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT； 所述引物扩增的与豌豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带为183bp，核 苷酸序列如Seq ID No. 3所示。2. 用于筛选包含豌豆抗白粉病基因erl-7的豌豆种质资源的试剂盒，其特征在于，包 括权利要求1所述的Indel标记引物； 所述Indel标记引物的核苷酸序列如下： InDel111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG； InDel111-120-R ：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT； 所述引物扩增的与豌豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带为183bp，核 苷酸序列如Seq ID No. 3所示。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或 电泳所需的试剂； 所述PCR反应所需的试剂包括：dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg' PCR反应缓冲液、标准阳 性模板、双蒸水和/或PCR MasterMix ; 所述电泳所需的试剂包括：TE缓冲液、聚丙烯酰胺、琼脂糖、四甲基乙二胺、甲醛、硝酸 银。4. 权利要求2或3任一所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包 括所述Indel标记引物； 所述Indel标记引物的核苷酸序列如下： InDel111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG； InDeI111-120-R :CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应 和/或电泳所需的试剂； 所述PCR反应所需的试剂包括：dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg' PCR反应缓冲液、标准阳 性模板、双蒸水和/或PCR MasterMix ; 所述电泳所需的试剂包括：TE缓冲液、聚丙烯酰胺、琼脂糖、四甲基乙二胺、甲醛、硝酸 银。6. 权利要求1所述Indel标记或权利要求2-3任一所述试剂盒在鉴定包含豌豆抗白粉 病基因erl-7的豌豆种质资源方面的应用，包括如下步骤： (1) 采用所述Indel标记引物对待测豌豆材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述Indel 标记引物的核苷酸序列如下： InDel111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG； InDel 111-120-R ：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT； (2) 对扩增结果进行电泳检测； (3) 从电泳结果中筛选出与豌豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带一 致的材料； 所述与豌豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带为183bp，核苷酸序列如 Seq ID No. 3 所示。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：豌豆基因组 DNA 2ng/y 1,2XPCR MasterMix 0.4 yl/yl，上下游引物各 0.2 ymol/L，其余为双蒸水。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95°C预 变性5分钟；以94°C 30秒，45°C -63°C 30秒，72°C 30秒为1个循环，35个循环；72°C 10分 钟。9. 根据权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于，所述电泳检测指，采用6%的聚丙 烯酰胺凝胶或者3. 5%的琼脂糖凝胶，于120V恒功率电泳分离，最后银染显色。
【专利摘要】本发明涉及一种与豌豆抗白粉病er1等位基因er1-7共分离的Indel标记InDel111-120及其应用，属于植物病理和农作物抗病遗传育种领域。扩增所述Indel标记的引物具有如下核苷酸序列：InDel111-120-F：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG，InDel111-120-R：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT；所述引物扩增的与豌豆抗白粉病基因er1-7共分离的Indel标记特征条带为183bp，核苷酸序列如Seq？ID？No.3所示。本发明还提供了基于所述Indel标记的用于筛选包含er1-7基因的豌豆种质资源的试剂盒。采用所述Indel标记或试剂盒可以快速准确地区分出含有抗性等位基因er1-7的豌豆资源，因此该标记或试剂盒可有效应用于豌豆抗白粉病的分子辅助育种中，高效准确、方便快捷，大大缩短育种周期、加速育种进程。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105154442
【申请号】CN201510599010
【发明人】孙素丽, 朱振东, 邓东, 王仲怡, 李银萍, 段灿星, 武小菲, 王晓鸣
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月18日