结合霍乱弧菌YbeY蛋白的核酸适配子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体设及能特异性高亲和力结合霍乱弧菌孔eY蛋白 的核酸适配子，及其在霍乱弧菌检测中的应用。
【背景技术】 阳00引弧菌属（Vibrio)中霍乱弧菌（V. cholerae)、引起一种烈性肠道传染病，发病急、 传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。霍乱（化Olera)是由Ol群和0139群霍乱弧菌 感染引起的一种烈性肠道传染病，是W发病急、传播快、波及范围广，能引起大流行为特征 的国际检疫传染病之一。
[0003] 霍乱弧菌包括两个生物型：古典生物型（Classicalbiotype)和埃尔托生物型 巧レTorbio-type霍乱弧菌）。运两种型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学 性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年W来，全球共发生 了屯次世界性大流行，前六次病原是古典型霍乱弧菌，第屯次病原是埃尔托型所致。
[0004] 1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株（0139)， 它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被Ol群霍乱弧菌 诊断血清所凝集，抗Ol群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较Ol群 霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株。 阳0化]人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口 传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能 藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤 发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此 毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈"米巧 水样"并含大量弧菌，此为本病典型的特征。
[0006] 我国把霍乱列为甲类法定传染病，是国境口岸重点检疫的传染病。因此，检测霍乱 弧菌是本领域一直致力研究的对象。传统的霍乱弧菌检测方法需要先分离再培养，然后用 经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是运些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、 特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式 反应（PCR)技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁 杂，因此在聚合酶链式反应（PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应（PCR) 技术，如多重PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引 物同时进行扩增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。而目前尚未有专口针 对霍乱肠毒素检测的报道。
[0007] 核酸适配子（aptamer)指能与蛋白分子W高亲和力结合的配基，是通过一种组 合化学技术一指数富集配基的系统进化技术（systematicevolutionofligandsby exponentialenrichment,SELEX)，从人工合成的大容量的单链随机寡核巧酸文库中通过 反复与祀分子作用-筛选、富集过程，筛选出的对祀分子结合具有高特异性和高结合性的 寡核巧酸分子，又可称为适配体。由于核酸适配子在功能上与传统抗体类似，与祀物质结合 的特异性和亲和力甚至优于抗体，加上其祀分子广、稳定性高、攻击祀分子的效率高、易改 造修饰等特点，已成为分子识别的有力工具，可在基础研究、临床快速诊断、药物研发等方 面得W广泛开发应用。
[0008] 孔eY是许多细菌机体中存在的一种保守蛋白，孔eY蛋白质的功能，发现其可W作 为一种RNA酶对RNA分子进行特殊剪切，从而调节RNA分子的可利用性和活性；而在运项研 究中研究者在霍乱弧菌中检测了该蛋白质的功能，研究者表示，蛋白质YbeY对于致病菌的 细胞适应性和应激耐受力，W及不同类别的RNA的调节非常关键。就像在高等有机体中一 样，DNA遗传信息可W转录成RNA分子，其中有些RNA分子可W作为蛋白质翻译的模板，而 有些RNA分子则可W形成细菌的蛋白质工厂（即核糖体），其它的RNA组分就会包含调节性 的RNAs,其可W调节细菌和宿主的细胞功能。
[0009] 研究表明孔eY蛋白对于产生功能性核糖体的必要组分非常关键，而且对于核糖 体的组装W及质量控制也非常重要。另外研究者还发现YbeY可WW致病菌毒力相关的调 节性小RNA分子为作用祀点进行作用，在感染霍乱的小鼠体内降低YbeY的水平可使得霍乱 弧菌的致病力下降；孔eY属于一系列保守的RNA酶类，其对于许多不同类别的致病菌，包括 肺炎链球菌和结核分枝杆菌都很重要。研究表明可WW孔eY作为一种新型祀点，运为开发 新型抗生素研发平台提供了新的研究思路；该蛋白质在许多致病菌中天然存在，对该蛋白 进行控制可W通过干扰细菌的应激耐受力和毒力来使得病毒对药物敏感，因此开发W该蛋 白质为祀点的抗生素将很有可能达到广谱的抗菌作用。
[0010] 本发明W霍乱弧菌为孔eY祀蛋白，利用SELEX技术筛选获得能与祀蛋白特异结合 的适配子，可用于检测霍乱弧菌。由于W单链DNA形式存的核酸适配子可采用化学方法在 体外合成，成本低廉，性质稳定，与祀蛋白亲和力高，可W在检测方法中直接应用，具有操作 简便快速等优点。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合孔eY蛋白，可W来实现霍 乱弧菌的特异性检测W及相应的治疗药物运送的祀向性，可用于霍乱的诊断与治疗。
[0012] 本发明采用W下技术方案： 阳01引体外合成一个含有40个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用大肠杆菌表达的方法体外表达孔eY，W其为祀蛋白，采用SELEX技 术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNAStruc化re Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配 子对祀蛋白的特异性和亲和力，得到了一系列的与表面抗原亲和力高、特异性强的适配子。 所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合YbeY 蛋白。所述适配子序列如下：
[0014] HLyb-003;TTCTTTATCTACCCCAACACCTTTCCACTTCCAGCCA
[0015] HLyb-003,；ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0016] TTCTTTATCTACCCCAACACCTTTCCACTTCCAGCCACACATGTGAGATTAACTGGACA
[0017] HLyb-004;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳O化]ATCTACCCCAACACCTTTCCACTTCACCCAAGAAAAA CACATGTGAGATTAACTGGACA ;
[0019] HLyb-006 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0020] AACACTCCAACTTATCCCTACAATTCTACTTTCATA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0021] HLyb-009 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0022] ACACCTTTCCACTTCCACCAAAAGAAATTCACATCAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0023] HLyb-Oll ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0024] TTCCACTTCCACCAAAGAAAATTCACATCACACATCA CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳0巧]HLyb-013 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0026] TTCCCTACAATATCTACTGTTCATATATTCCTCACTT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0027] HLyb-O15 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0028] ATCACACATCATCACACCACCGCCCTTCCAACTACCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0029] HLyb-016 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0030] ATTCCTCACTTAATCAACATTTCTTCATTGTTTCTCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0031] HLyb-O17 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0032] TCAAACAATTATCAGAATTTCTATAACACTTCAATTC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0033] HLyb-O19 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳的4] ACCCCGCCTTCTCAAACAATTTCAAATTATCTATAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0035] HLyb-020 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0036] CCATACACATTAACCCGACCCTTCTCAAACAATTTCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0037] HLyb-021 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳的8] TTATAATTTGTTCATTACCTAAATATCCAACCCATCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0039] HLyb-023 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0040] CACACCCACCATTGTTAACACAACCTACCTTTTTCCT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0041] HLyb-024 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0042] TCACATTACAAAATACATTCATCCGCCAACACACCAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0043] HLyb-026 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0044] CCACATACCTGTTTATATCAAAATATAAAAACCCAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0045] HLyb-028 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0046] CACCCTTATCTACACTAAAGAAATTTCCTCACCACCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0047] HLyb-030 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0048] CAATCCTCAAACTCTACCTAAGAATAACACTTACCTC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0049] HLyb-033 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳0加]AAATAACAGAATCCTCCACACACACCCACTTATAAAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0051] HLyb-036 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0052] ACCGCCTACAACTACATCACACTCCTATTCCTATATC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0053] HLyb-039 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0054] ATCGCTACCTTAATACCTATAACTTTACTCCTAAAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳化5] HLyb-040 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳化6] CAAACAACACACACAACCACGCTCCATAACCCCACAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0057] HLyb-042 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0058] TACCCAAATTCTATCCAACGCTTACCTTCCAAACATC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0059] HLyb-061 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0060] ATACCTTCCTATACCGCTTCACTCTACTTACCTCTCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0061] HLyb-063 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0062] CATCCCTAATAACTACTGTTA