低表达或不表达perv的肝细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种转基因技术，尤其设及一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 当今，重型肝炎、肝衰竭W及肝癌是我国肝病死亡的主要原因，肝移植是治疗此类 疾病最有效的方法。但是，人类同种器官移植供体却早已日益短缺，大多患者在等待器官 供体的过程中丧失生命。寻找肝衰竭患者在肝移植前替代手段成为重中之重。生物人工 肝度AL)是目前国内外公认的最接近自然肝脏，功能也最全面的人工肝脏支持系统。生物 人工肝由反应器和细胞材料组成，肝细胞是整个生物人工肝系统的核屯、材料。在生物人工 肝领域中，因猪解剖、生理特点与人类相似，猪细胞来源广泛，经济适用，因此目前应用最多 的生物部分是猪肝脏细胞。但目前已知，作为异种细胞猪肝细胞内存在着猪内源性逆转录 病毒（porcineendogenousretrovirus,阳RV)，有引起生物人工肝治疗患者阳RV感染的危 险。体外培养实验、假型实验和感染性实验已经证实PERV可W感染人源细胞。 阳00引阳RV是一种RNA病毒，其前DNA整合到猪的基因组中。它在猪的基因组中多拷贝 而且与mRNA的表达量在不同猪种有很大的差异。现有的PERV减活或消除手段都未能很好 地降低PERV的感染风险。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为克服现有技术的不足提供一种低表达或不表达PERV的肝细胞 的制备方法。 阳0化]为达到W上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其包括W下步骤：
[0007] (1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的SiRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9 技术的曲NA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的化s9的载体；
[0008] (2)将所述=种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴 定W获得单克隆转基因猪体细胞；
[0009] (3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；
[0010] (4)提取所述转基因猪的肝细胞。
[0011] 优选地，所述含有SiRNA的重组载体、含有曲NA的重组载体和含有化s9的载体W 1 :1 :1的比例混合W进行共同转染。
[0012] 进一步地，所述SiRNA根据阳RV基因的编码区POl和gag片段进行设计。
[0013] 优选地，用于将所述SiRNA转染到目标细胞的载体为PsiIencerf. I-Hl-Neo。
[0014] 更进一步地，所述曲NA的序列为SEQNo. 1所示。所述曲NA的PCR引物的序列为 沈QNo. 2和沈QNo. 3所示。
[0015] 再进一步地，用于将所述曲NA转染到目标细胞的载体为U6-gRNA。
[0016] 优选地，所述含有化s9的载体为pCMV-hCAS9。
[0017] 优选地，所述猪体细胞为猪胚胎成纤维细胞。
[0018] 与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
[0019] (1)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，通过RNA干扰技术和 CRIPRS/tas9技术相结合，既抑制了PERV的转录后表达，又实现了对PERV的转录前敲除，有 效降低了转基因猪体细胞的PERV的活性；
[0020] 似本发明的低表达或不表达阳RV的肝细胞的制备方法，对阳RV的保守编码区进 行重组载体的设计，几乎实现完全沉默，由此可W应用于不同品种的猪种，增加了可提供异 源肝细胞的猪的品种； 阳02U (3)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，将S种质粒载体共同转 染到目标细胞，节约了转基因猪体细胞的制备时间，提高了转基因猪体细胞的制备效率；
[0022] (4)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法所获得的转基因猪因其 自身的PERV具有低表达或不表达的特性，该转基因猪的其他细胞、组织或器官都可W用于 作为人的异源供体。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明低表达或不表达阳RV的肝细胞的制备方法中含有SiRNA的重组载 体结构示意图。
[0024] 图2为图1所示的载体的酶切鉴定结果示意图。
[0025] 图3为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中用于连接曲NA的载体 的结构示意图。
[0026] 图4为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中所使用的化s9载体的 结构不意图。
[0027] 图5为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细 胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-2。
[0028] 图6为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细 胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-3。
[0029] 图7为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细 胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-6。
[0030] 图8为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细 胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-9。
【具体实施方式】
[0031] W下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
[0032] 本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法包括W下步骤：
[0033] 一、重组载体的设计与制备
[0034] (1)制备应用于RNA干扰的重组载体 W35]RNA干扰（RNAinterference,RNAU是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
[0036] 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并 利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对运些dsRNA迅即产生反应，其 胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约 21~23bp)，即siRNA。SiRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由 反义SiRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复 合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区 进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与SiRNA中 反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对运些mRNA 的降解反应。SiRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与祀RNA结合并 在RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合 成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级SiRNA,从而使RNAi的作用进一步放大，最终将 祀mRNA完全降解。
[0037] 所谓RNAi技术，就是人们在真核细胞中引入针对特定基因的SiRNA,便可W特异 性剔除或关闭特定基因的表达，实现所述特定基因的转录后水平的基因沉默。
[0038] 针对本发明所设及的PERV基因，查文献获得针对PERV编码区POl和gag片段，设 计并筛选出四个干扰PERV表达相对高效的SiRNA,使用RNAi软件，针对筛选到的SiRNA合 成shRNA并加入折叠序列的编码DNA序列，四个片段分别为：gagl、gag4、pol2、pol3 ;每个 片段分别对应连接一个启动子，连接后的长片段为gagl-Hl-gag4-h7sk-pol2-mU6-pol3,其 中Hl、h7sk和mU6分别为启动子。所述长片段两端再连入化ndIII和BamhI酶切位点，连 入Psilencer3.I-Hl-Neo载体，最后得到如图 1 所示的Psilencer3. 1-Hl-Neo-shRNA重组 载体。
[0039] 进一步地，所述Psilencer3. 1-Hl-Neo-shRNA重组载体的酶切鉴定体系如下：
[0040] 质粒IulHind III化如1 BamhI0. nuT Buffer Iul Water了地
[0041] 若鉴定结果出现如图2所示的条带，证明所述Psilencer3. 1-Hl-Neo-shRNA重组 载体构建成功。 阳0创 似分别制备应用于CRIPRS/化s9的曲NA重组载体和化s9载体
[0043]CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是 一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中， CRISPR系统共分成3类，其中I类和III类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥 作用，