（mk）产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物发酵行业，特别是设及一种利用添加诱导物质提高黄杆菌发酵生 产MK产量的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素K(VitaminK，VK)是一族含有共同化学结构"2-甲基-1，4-糞酿环"的物 质的统称。根据糞酿环3'位置所连接侧链化学结构不同，VK又可分为不同类别。天然存 在的VK主要有两种类型，即VKi(Ph}dloquinore，PK，叶绿酿类）和VK2(Menaquinone，MK， 甲糞酿类），两者均属脂溶性维生素，且均可由微生物合成。VKi主要由植物产生，VK2主要 由微生物产生。而人工合成的VK有VK3、VK4、VKg等。其中，在动物体内具有生物活性的是 VKz,而VKi和VK3均需转化为MK才能发挥作用（其结构及性质如表1所示）。VK3是通过人 工合成的，在自然界中是不存在的，主要是作为合成VKi和VKz的中间体和饲料添加剂，通常 W亚硫酸盐形式即亚硫酸氨钢甲糞酿的形式存在。
[000引 MK的化学结构式为2-甲基-3-戊締醇基-1，4-糞酿，是系列化合物。依据C-3上 异戊二締侧链长度的不同共有14种W MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二締单元的个 数。
[0004] 表1维生素Ki,Kz和维生素K3的结构及性质 阳0化]
[0006]目前研究结果表明，能够合成MK的生物都是原核生物。一般地，革兰氏阳性菌能 够合成MK;革兰氏阴性菌中，专性厌氧菌能够合成MK，兼性厌氧菌不但能够合成MK而且能 合成辅酶Q(Co曲，而需氧菌不能合成MK，只能产生CoQ。然而，能够合成较高产量MK的菌 种为数不多。考查已有的相关研究文献不难发现，能够进行发酵生产MK的菌种主要是属于 革兰氏阴性菌产的黄杆菌（Flavobacteriumsp.)，该菌种目前主要合成MK-4和MK-6;属于 革兰氏阳性菌的枯草杆菌度acillussubtilisnatto,日本文献称之为纳豆菌），主要合成 MK-7。
[0007] 但W黄杆菌生产MK存在产量较低的问题，为了提高其合成产量，人们主要采取了 通过各种诱变手段得到诱变菌株和将优化的黄杆菌培养基与发酵培养条件相结合的措施， 但产量的提高幅度较小，仍然无法满足需求。而通过向培养基中添加诱导物质如1，4-二径 基-2-糞甲酸值HNA)或者其结构类似物质VKs(亚硫酸氨钢甲糞酿）W及异戊締醇灯WXC) 等促进MK在黄杆菌内的生物合成、提高MK产量的方法却鲜有报道。
【发明内容】
[0008] 本发明要提供一种利用添加诱导物质提高黄杆菌合成MK产量的方法，W克服现 有技术黄杆菌发酵生产MK产量低的问题。
[0009] 为实现上述技术问题，本发明所采取的技术方案为：
[0010] 一种利用添加诱导物质提高黄杆菌合成MK产量的方法，包括W下步骤：
[0011] (1)黄杆菌菌株菌种活化：从冻存甘油管中挑取一环菌液采用划线稀释法划线或 者稀释涂板法涂板于固体培养基的平板上，在25~37°C下倒置培养24~4她，挑取单菌落 接种至含固体培养基的新鲜斜面上，继续保持溫度倒置培养20~30h，所述固体培养基的 成分包括10~40g/L麦芽糖、10~40g/L玉米浆、0. 5~lOg/L蛋白腺、0. 2~2g/L酵母提 取物、0. 5 ~5g/LK2HP04、0. 5 ~5g/L化C1、0. 1 ~0. 5g/LM拆〇4? 7&0 和 15 ~20g/L琼 脂粉。
[0012] (2)黄杆菌菌株种子培养：挑取步骤（1)中生长成熟的斜面用接种环刮取一环菌 苔接种于盛有50~100mL种子培养基的500mlS角瓶中，在25~37°C，100~200巧m振 荡培养20~3化制得种子液，所述种子培养基成分包括10~40g/L麦芽糖、10~40g/L玉 米浆、0. 5~lOg/L蛋白腺、0. 2~2g/L酵母提取物、0. 5~5g/LK2HP04、0. 5~5g/L化Cl 和 0. 1 ~0. 5g/LM拆〇4? 7&0,且在 110 ~130°C灭菌 15 ~30min。
[0013] (3)黄杆菌菌株发酵培养：按2~10%接种量将步骤（2)的种子液接种于盛有 50~100mL发酵培养基的250ml=角瓶中，并在发酵0~9化其始至此后的48小时内，将 诱导物质1，4-二径基-2-糞甲酸2. 5~50mg/L添加入发酵培养基，在25~37°C，100~ 200巧m振荡培养5~7天。所述发酵培养基成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、0. 5~ lOg/L蛋白腺、0. 2 ~2g/L酵母提取物、0. 5 ~5g/LK2HP04,0. 5 ~5g/L化Cl和 0. 1 ~0. 5g/ LM拆〇4? 7&0。
[0014] 优选的，步骤（1)中所述固体培养基的成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、IOg/ L蛋白腺、1. 5g/L酵母提取物、4. 5g/LK2HP〇4、3g/L化C1、0. 3g/LM拆〇4? 7&0 和 18g/L琼 脂粉。
[0015] 优选的，步骤（2)中所述种子培养基的成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、IOg/ L蛋白腺、1. 5g/L酵母提取物、4. 5g/LK2HP〇4、3g/L化Cl和 0. 3g/LM拆〇4? 7&0。
[0016] 优选的，步骤（3)中所述接种量为5%，发酵培养基成分包括30g/L麦芽糖、 20g/L玉米浆、lOg/L蛋白腺、1. 5g/L酵母提取物、4. 5g/LK2HP〇4、3g/L化Cl和 0. 3g/L M拆〇4? 7&0。
[0017] 优选的，步骤（3)中所述诱导物质由2. 5~50mg/L亚硫酸氨钢甲糞酿或10~ 250mg/L异戊締醇代替。
[0018] 优选的，步骤（3)中所述诱导物质是含量为50mg/L的1,4-二径基-2-糞甲酸、 50mg/L的亚硫酸氨钢甲糞酿或250mg/L的异戊締醇中的任一种。
[0019] 优选的，步骤（3)中所述诱导物质的添加于发酵6化始到10化止的4她内，进行 5次分别添力日，每次间隔12h，即在发酵60h、72h、84h、96h、10化时。
[0020] 优选的，步骤（3)所述诱导物质的添加于发酵7化始，12化止，每间隔12h，共计5 次，即在发酵72h、84h、96h、10化、120h时每次将无菌的亚硫酸氨钢甲糞酿按5mg/L添加入 培养基。
[0021] 优选的，步骤（3)所述诱导物质的添加于发酵6化始，10化止，每间隔12h，共计 5次，将无菌的lOmg/L1，4-二径基-2-糞甲酸添加入培养基，另外在9化时添加无菌的 lOmg/L亚硫酸氨钢甲糞酿，在10化时添加无菌的lOmg/L1，4-二径基-2-糞甲酸。
[0022] 优选的，步骤（3)所述发酵为分批补料式发酵。
[0023] 与现有技术相比本发明所取得的有益效果为：本发明通过向发酵培养基中添加前 体物质1,4-二径基-2-糞甲酸、前体类似物VKs或异戊締醇（YWXC)作为诱导物质，有效地 促进了MK在黄杆菌中的生物合成，与对照组相比，MK的产量显著提高，MK产量对菌体干重 比也得到了较大幅度提高。该方法操作简单、可控性强、结果稳定，利用黄杆菌发酵生产MK， 安全环保。此外，利用添加诱导物质可有效提高黄杆菌合成MK的产量，为工业化大规模生 产维生素MK提供新的思路和方式。
【附图说明】
[0024] 图1为在发酵起始添加不同含量诱导物质即实施例1~3所得菌体生物量、MK产 量和MK产量对菌体干重比分别随DHNA、VKs和异戊締醇灯WXC)添加浓度增加的变化曲线 (-□-代表菌体生物量，一A-代表MK产量，一?一MK产量对菌体干重比，即单位菌体 MK产量）。 阳02引图2为在发酵7化时一次性添加50mg/LVKs作为诱导物质即实施例4所得MK相 对产量和MK产量对菌体相对干重比提高比率柱状图。 W26] 图3为实施例5~10所得MK相对产量和MK产量对菌体相对干重比随畑NA、VKj 和异戊締醇（YWXC)在不同添加浓度和添加起始时间情况下的提高的比率柱状图。
[0027] 图4为实施例11~16所得MK相对产量和MK产量对菌体相对干重比随畑NA、VK3 和异戊締醇（YWXC)在不同添加浓度和添加起始时间情况下的提高的比率柱状图。
[0028] 图5为实施例17~22所得MK相对产量和MK产量对菌体相对干重比随畑NA、VK3 和异戊締醇（YWXC)在不同添加浓度和添加起始时间情况下的提高的比率柱状图。
[0029] 图6为典型案例实例23中复合添加DHNA和VK3后黄杆菌合成MK与对照组的黄 杆菌发酵历程对比。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步具体说明。 阳0川实施例1
[0032] (I)黄杆菌菌株菌种活化：从冻存甘油管中挑取一环菌液可采用划线稀释法划线 于含固体培养基的平板上，在25°C下倒置培养2地，挑取单菌落接种至含固体培养基的新 鲜斜面上，继续保持溫度倒置培养20h，上述固体培养基的成分包括lOg/L麦芽糖、lOg/L玉 米浆、0. 5g/L蛋白腺、0. 2g/L酵母提取物、0. 5g/LK2HP04、0. 5g/L化C1、0.Ig/LM拆〇4.7&0 和15g/L琼脂粉。
[0033] (2)黄杆菌菌株种子培养：挑取生长成熟的斜面用接种环刮取一环菌苔接种于盛 有50ml种子培养基的500mlS角瓶中，在25°C，100巧m振荡培养2化制得种子液。种子 培养基成分包括lOg/L麦芽糖、lOg/L玉米浆、0. 5g/