的HybridizationBuffer,封口，解育 至少5min后再进行下一步的实验；
[014引 6.将PCR板 1 的SureSelectCap1:ureLibraiTMix加入到PCR板 2 中：
[0144] (1)在PCR板 2 的C排，加入 7化的CapUireLibraryMix(PCR板需保持 65°C);
[0145] (2)密封盖子；
[014 引（3)65°(：解育2111111;
[0147] 7.从A排取 13JiL的HybridizationBuffer,加入到C排的SureSelectCap1:ure LibraryMix中（PCR板需保持 65°C);
[014引 8.将B排中准备的样品文库混合液全部加入到C排的杂交液中，用移液枪轻轻混 匀8-10次（PCR板需保持65°C);
[0149] 9.用新的胶膜将PCR板密封；
[0150] 10.在PCR仪上（热盖105°C)，将杂交混合液65°C解育2地。
[0151](二）准备磁珠
[0152] 1.在 1. 5ml离屯、管中，加入 50JiL的StreptavidinTl磁珠；
[0153] 2.磁珠洗脱：
[0154] (1)加 200JiL的SureSelectBindingBuffer;
[01巧](2)縱满混合器上混匀5s;
[0156] (3)将离屯、管放在磁力架上；
[0157] (4)移去上清；
[0158] 妨再重复步骤（1)到（4)两次，共洗脱3次；
[0159] 3.加入 200JiL的SureSelectBindingBuffer重新悬挂磁珠。
[0160] (S)用SureSelecte系统进行选择性杂交捕获
[0161] 1.溫育2地后，确定并记录杂交体积；
[0162] 2.保持PCR板在PCR仪上65°C，将杂交混合液直接加入到磁珠溶液中，颠倒混匀 3-5 次；
[0163] 3.将杂交-捕获和磁珠的混合液放置在混合器上，室溫溫育30min;
[0164] 4.短暂的离屯、；
[0165] 5.放置在磁力架上，静置5min，移去上清；
[0166] 6.加入 500yL的SureSelectWashBuffer#l，縱满混合 5s;
[0167] 7.室溫溫育，共15min，但需每隔5min縱满混匀5s;
[016引 8.短暂的离屯、；
[0169] 9.放置在磁力架上，静置5min，移去上清；
[0170] 10.洗涂磁珠：
[017U (I)加 500yL在 65°C预热的SureSelectWashBuffer#2,縱满混匀 5s;
[017引 （2)在65°C溫育lOmin，每隔3min混匀一下；
[0173] (3)短暂离屯、；
[0174] (4)放在磁力架上，静置5min，移去上清；
[017引 妨再重复步骤（1)到（4)两次，共洗脱3次；
[0176] 11.加 50JiL的SureSelectElutionBuffer,縱满混匀 5s;
[0177] 12.室溫溫育lOmin，每隔3min混匀一下；
[017引 13.短暂离屯、；
[0179] 14.放磁力架上，静置5min;
[0180] 15.将上清转移到新的1. 5ml离屯、管（得到捕获的DNA文库）；
[01引]16.加 50JiL的SureSelectNeutralizationBuffer到捕获的DNA文库中，并短 暂縱满混匀。
[0182](四）用AMPure磁珠纯化样品
[0183] 1.加180yL磁珠到1. 5ml离屯、管，再加100yL捕获的DNA文库，縱满混匀；
[0184] 2.混合液 26°C，溫育 5min;
[0185] 3.将离屯、管放置在磁力架上，静置lOmin，弃上清；
[0186] 4.加入70 %乙醇500yL静置Imin,弃上清；
[0187] 5.重复步骤4,再洗一遍；
[018引 6.将离屯、管放在37°C，溫育5min，使乙醇充分挥发；
[0189] 7.加入 30JiL的Nuclease-freeWater,縱满混匀，室溫解育 2min;
[0190] 8.将离屯、管放置在磁力架上，静置3min;
[0191] 9.小屯、移取上清至新的1. 5ml离屯、管内备用。
[0192](五）捕获样品扩增
[0193] 在超净工作台中，取PCR管，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态；
[0194]
阳195] 配好体系后，用移液枪轻轻混匀；
[0196] ^PCR扩增条件
[0197]
[0198] (六）AMPure磁珠纯化PCR产物
[0199] 1.加90yL磁珠到1. 5ml离屯、管，再加50yL扩增的PCR产物，縱满混匀；
[0200]2.混合液 26°C，溫育 5min;
[0201] 3.将离屯、管放置在磁力架上，静置lOmin，弃上清；
[0202] 4.加入70 %乙醇500化，静置Imin,弃上清；
[0203] 5.重复步骤4,再洗一遍；
[0204]6.将离屯、管放在37°C，溫育5min，使乙醇充分挥发；
[020引 7.加入30yL的Nuclease-freeWater,縱满混匀，室溫解育2min;
[020引 8.将离屯、管放置在磁力架上，静置3min;
[0207] 9.小屯、移取上清至新的1. 5ml离屯、管内备用；
[020引 10.取 1yL用Agilent2200 检测；
[0209] 11.取化1用如bit2. 0定量。
[0210] 五、上机测序：
[021。 96个样品在iIlumina公司的Miseq进行上机测序。
[0引引六、数据分析：
[0213] 数据结果通过化CGenomicsWoricbench7. 0进行生物信息学分析。
[0214] 屯、结果：
[0215] 通过1次测序，2天完成270个样品所有2个目的基因170条序列的测序工作，测 序总数达到459006条。用ABI3730X1进行2个基因的平行对照，突变检出率为65%。而本 方案的测序突变检出率达到88%，检验准确率100%。
【主权项】
1. 一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒，其包括：捕获目的NR3C I 基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测 序接头序列；缓冲液；dNTP ;高保真聚合酶；链霉素磁珠。2. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"，全 部探针在3'采用生物素修饰。3. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"这 种探针是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸（DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以 包括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。4. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"的 探针是结合在磁珠上的，或结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。5. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"的 探针针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与NR3C 1为互补序列。6. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"探 针长度在50-180bp，最优为75bp。7. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"探 针长度在60-200bp，最优为80bp。8. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"探 针长度在65-2200bp，最优为85bp。9. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"探 针长度在70-240bp，最优为90bp。10. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"探 针重叠部分适宜范围为5bp_20bp，最优为8bp。11. 根据权利要求1所述"一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒"链 霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶 磁，但不仅限于这些材质。
【专利摘要】本发明涉及一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因的产品，该试剂盒包括：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因NR3C1全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105154520
【申请号】CN201410613209
【发明人】刘哲
【申请人】百世诺（北京）医疗科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年11月5日