一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种检测羊泰勒虫（巧eiieriaSPP)和无 浆体（心3如<3細aspp)的双重PCR方法。 技术背景
[0002] 羊泰勒虫病是由羊泰勒虫属病原引起的绵羊和山羊的一种婢传性血液原虫病。 该病最早于1914年由Jittlewood发现于埃及的绵羊，杨辅国等在中国首次报道。在某些 地区，羊泰勒虫感染率高达95 %，病羊表现高热、体表淋己结肿大、贫血和消瘦等症状，严重 时导致死亡，给我国养羊业造成很大危害。羊无浆体病(俗称边虫病）是由无浆体属的病原 引起的婢传性血液立克次体病，绵羊和山羊感染时主要表现高热、贫血、黄痘和渐进性消瘦 等，严重感染时可导致死亡，其中嗜吞隧细胞无浆体作为一种人和多种动物的人兽共患病 病原，具有公共卫生学意义，受到人们的高度重视。我国自1982年在新疆绵羊体内发现羊 无浆体W来，目前很多地区均有报道。
[0003] 目前，血液原虫诊断方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫吸附试验巧LISA)、间接 巧光抗体试验（IFA)、聚合酶链式反应（PCR)等。其中使用最广泛的是涂片染色镜检，该方 法设备简单、操作简便，但是检测率低，适合于病畜的检测，但在检测无症状感染(带虫）时 则易出现假阴性或假阳性。Glen等（2007)证实了ELISA方法能够有效且可靠的诊断家养 羊的绵羊无浆体病和野生有蹄类动物的无浆体病。赵帅阳（2014)W中华泰勒虫MSP重组 蛋白为抗原建立了牛泰勒虫间接化ISA方法。ELISA方法只能说明被检动物是否感染过某 种病原，不能检测到当时是否正处于感染状态。Ogunremi报道了间接巧光抗体试验和补体 结合试验用于检测马泰勒虫。间接巧光抗体试验和补体结合试验方法操作繁琐，不宜用于 大批量样品的检测。
[0004] 单PCR扩增结合测序方法临床上用于多种寄生虫的敏感性和特异性的检测。羊泰 勒虫和无浆体都是W硬婢为媒介在羊中传播的，因此在一些地区混合感染两种病原的现象 很常见。Renneker等报道，在检测的195份羊血液中有45份混合感染羊无浆体、泰勒虫、己 贝斯虫，感染率达到23%。目前，多采用单PCR检测某种病原，其优点是可W分别设定反应 参数保证扩增效率较高，且能分别检测相近大小的病原或基因，但单PCR-次只能检测一 种病原或一个基因，当需检测多种病原或多个基因，或检测未知病原体的混合感染时，应用 单PCR方法对单一病原的检测需多次扩增筛选，费时费力，且成本大大增加。A化assan等根 据18SrRNA基因的特征设计特异性二重PCR引物，可同时鉴别扩增马己贝斯虫和驾己贝斯 虫。多重PCR反应可节约试剂、反应时间和电泳时间，同时各对引物在扩增时的竞争使检测 具有较低的假阳性率。因此，与单PCR方法相比，多重PCR方法具有更准确、高效、经济的特 点。
[0005] 中国发明专利201510101859. 6建立了多重PCR方法检测与区分牛环形泰勒虫 和东方泰勒虫；专利201410476184. 9建立了检测所有泰勒虫的引物、探针及试剂盒和扩 增体系，用来检测所有泰勒虫；20131010195. 5建立了多重PCR鉴定试剂盒用于鉴定羊吕 氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫；201410332786. 7采用LAMP技术检测牛无浆体；201210137237. 5建立了检测绵羊无浆体的试剂盒。目前，有关同时检测泰勒虫和无浆体的 方法尚未见报道。本试验所建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性和重复性好、样品用 量小、节省时间和费用等优点，对于巧SPP和^化SPP流行病学调查和病原 鉴定具有重大意义。
【发明内容】
[0006] 针对目前羊泰勒虫和无浆体的检测方法检出率低、操作繁琐等问题，本发明依据 羊泰勒虫18S rRNA和羊无浆体16S rRNA基因保守序列为祀基因位点，建立了一种能同时 快速检测检测羊泰勒虫（巧eWe'ia spp)和无浆体（心邸知細3spp)的双重PCR方法。该 法W具有快速、特异、灵敏、高效、低成本等特点，为羊泰勒虫病和无浆体病的快速诊断及流 行病学调查提供了适用先进技术。
[0007] 本发明提供一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，包括W下步骤： (1) 引物设计 根据GenBank登录号：AF081136. UKJ188221. UAY260172. UAF081137. UU97052. 1， 用DNAMAN软件比对羊泰勒虫18S rRNA基因序列，找到基因保守序列祀基因位点，设计了 特异性引物序列I为：上游引物Tf :5' ATTCCCGCATCCTATTTAGCAG 3'和下游引物化：5' CGACTCCTTCAGCACCTT 3'； 根据GenBank登录号JQ917906. 1、AY149637. 1、JF514513. 1、AF311303. 1，用DNAMAN软件比对羊无浆体16SrRNA基因序列，找到基因保守序列为祀基因位点，设 计了特异性引物序列II:上游引物Af:5'ACACGGTCCAGACTCCTACG3'和下游引物Ar: 5'AGGTACCGTCATTATCTTCCCTACT3'； (2) 羊泰勒虫DNA及羊无浆体DNA的提取：使用血液基因组DNA提取试剂盒按照说明 书提取待测血液样品DNA; (3)W设计的特异性引物序列I的上、下游引物和特异性引物序列II的上、下游引物 为引物，WSPP和心邸知細3SPP阳性样品及阴性对照为模板，PCR混合液加入 PCR扩增管中，进行双重PCR反应条件优化及双重PCR特异性试验、敏感性试验及重复性试 验。
[0008] (4)将PCR扩增管置于PCR扩增仪中进行循环； (5)取PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳。
[0009] 所述扩增产物中羊泰勒虫属的核巧酸序列大小为298bp，羊无浆体属的核巧酸序 列大小为139bp。
[0010] 步骤（3)中PCR混合液包括：采用25化的PCR反应体系，2化模板，2. 5化IOXPCR Buffer缓冲液，2化的dNTPMixture,特异性引物序列I上、下游引物各0.47化，特异性 引物序列II上、下游引物各0.53化，0.2yLTaqDNA聚合酶，灭菌水补至25化，混匀； 其中W上各个引物的浓度均为25iiM。
[0011] 于步骤（4)中PCR的扩增条件：95 °C预变性5min，95°C变性35s，56°C退火45 s，72 °C延伸50s，36个循环，72°C后延伸7min。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果： 本发明有W下优点：（1)操作简单；只需一个反应物体系进行一次扩增可同时检测两 个属病原，省时省力。（2)特异性高；设计2对引物可特异识别羊泰勒虫18SrRNA祀基因 和无浆体16SrRNA祀基因。（3)结果判定简单；琼脂糖凝胶电泳中见298bp、139bp两条 带，可判断感染两种病原，只见一条带可判断感染了 spp(298bp)或^/7邸7<367&3 spp(139bp)。（4)本发明基于羊 spplSSrRNA勒!基因和心3如<36曲asppl6S rRNA祀基因建立的双重PCR方法特异性高，可检测羊spp( 7： 6邸化ra的T. ]Mwenshuni'々WAnaplasmasppiA. 〇vis；A.bovis;A.phagocytophilund。该'法W具有快 速、特异、灵敏、高效、低成本等特点，为羊泰勒虫病和无浆体病的快速诊断及流行病学调查 提供了适用先进技术。
【附图说明】
[001引图1扩增体系中不同溫度双重PCR扩增电泳结果图； 其中，泳道1 :48°C，泳道2 :50 °C，泳道3 :52°C，泳道4 :54°C，泳道5 :56°C，泳道6 : 58°C，M:表示DNAMarker(DL2000): 图2扩增体系中不同IOXBuffer量双重PCR扩增电泳结果图； 其中，泳道1:1化；泳道2:1.5化；泳道3:2化；泳道4:2. 5化；泳道5:3化； 泳道6 :阴性对照；泳道7 :空白对照；M:表示DNAMarker(DL2000) 图3扩增体系中不同dNTP量双重PCR扩增电泳结果图； 其中，泳道1:1yL;泳道2:1. 5JiL;泳道3:2JiL;泳道4:2. 5JiL;泳道5:阴性对 照；M:表示DNAMarker(DL2000) 图4扩增体系中不同rTaq酶量双重PCR扩增电泳结果图； 其中，泳道1 :0.1yL;泳道2 :0.13yL;泳道3 :0.15yL;泳道4 :0.17yL;泳道 5:2yL;泳道 6 :阴性对照；M:表示DNAMarker(DL2000) 图5扩增体系中不同引物浓度双重PCR扩增电泳结果图； 其中，泳道 1 :0. 4:0. 4 ;泳道 2 :0. 4:0. 6 ;泳道 3 :0. 45: 0. 55 ;泳道 4 :0. 5:0. 55 ;泳道 5 :0. 5:0. 5 ;泳道 6: 0. 47:0. 53;泳道 7 :阴性对照；M表示DNAMarker(DL2000) 图6检测无浆体属和泰勒虫属的双重PCR方法特异性试验电泳结果图； 其中，A图泳道1 :泰勒虫无浆体阳性样品；泳道2 SPP阳性样品；泳道 3:乂舶公7况KSsppDNA;泳道 4:妳况KSOKis;泳道 sppDNA;泳道 6:灭菌 蒸馈水；M表示DNAMarker(DL2000) ;B图泳道1 :泰勒虫无浆体阳性样品；泳道2 :乂"Kis;文永道 3 :AboViSx文永道 4: A.phagocytophiIum-,M5 ：T.separate.、泳道 6 : 7. Iuwenshuni敵诺.7 :灭菌蒸馈水；M表示DNAMarker(DL2000) 图7检测无浆体属和泰勒虫属的双重PCR方法敏感性试验电泳结果图； 其中，A图泳道1 :泰勒虫阳性样品；泳道2-7稀释样品稀释从10 1~10 6;泳道8;阴性 对照；M:表示DNAMarker(DL2000);B图泳道1:无浆体阳性样品；泳道2-7稀释样品稀 释从10 1~10 6泳道8;阴性对照；M:表示DNAMarker(DL2000);C图：泳道1:无浆体和泰 勒虫阳性样品；泳道2-7稀释样品稀释从10 1~10 6泳道8 ;阴性对照；M:表示DNAMarker (DL2000) 图8检测无浆体属和泰勒虫属的双重PCR方法重复性试验电泳结果图； :其中，泳道1-3 :重复性；泳道4 :阴性对照；M:表示DNAMarker(DL2000) 图9检测无浆体属和泰勒虫属的双重PCR方法临床试验一电泳结果图； 泳道1-46 :PCR产物（PCRproduct),泳道47 :阳性对照；泳道48 :阴性对照；M:表示DNAMarker(DL2000) 图10检测无浆体属和泰勒虫属的双重PCR方法临床试验二电泳结果图； 其中，泳道1-3 :PCR扩增结果；泳道4 :阴性对照；M表示DNAMarker(DL2000)。
【具体实施方式】
[0014] W下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述： 本发明试验试剂、仪器主要有： 羊血液样品采自贵州省，使用上海莱枫生物科技有限公司生产的血液基因组DNA提 取试剂盒。无浆体阳性样品由本实验室保存，泰勒虫、羊附红细胞体、己贝斯虫阳性样 品由华中农业大学赵俊龙教授馈赠。化qDNA聚合酶（抓//yL)、10XPCRBuffer、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)、克隆载体pMD18-T、2000bpDNAladder购自大连宝生物工程有 限公司；PCR扩增仪（Bio-Rad公司）；微量紫外分光光度计；凝胶