基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学检测技术领域，具体设及一种基于水解探针法的快速检测地中海 贫血罕见缺失型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常 见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有a-地贫和0-地贫。中国人群中，a-地贫 的基因型常见的为缺失型一SE\-a17和-a4^2。申请人在日常检测中发现a地贫中的泰国 型缺失（一THAI)W及0地贫中的HPFH-SEA和中国型缺失（G丫+ (A丫 5 0)0，简写为DBT)在 相对罕见的缺失型地贫中占有较高的比例，而运些地贫等位基因并未在常规地贫检测试剂 盒W内。为了避免运些罕见等位基因的漏筛，需要建立一种可W快速诊断一THAI、HPFH-SEA 和DBT等位基因的检测试剂盒。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕 见缺失型的试剂盒。采用该试剂盒可W实现该试剂盒可W实现单管单次反应完成一THAI、 HPFH-SEA和DBT运3种罕见缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定 性和准确性，W及较高的特异性。
[0004] 本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒，包括 扩增引物和巧光探针，其特征在于：
[0005] 所述的扩增引物为：一对扩增a-珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的 引物THAI-F和THAI-R，一对扩增0 -珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和 HPFH-R，一对扩增0 -珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R，W及一对扩增 a-珠蛋白基因簇中a1区段等位基因的引物Al-F和Al-R; 阳006] 所述的巧光探针为：一条特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的巧光探针 THAI-Prob, -条特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的巧光探针HPFH-Prob, -条特异性 检测DBT-F和DBT-R扩增产物的巧光探针DBT-Prob,W及一条特异性检测Al-F和Al-R扩 增产物的巧光探针Al-Prob;
[0007]其中： 阳00引扩增a-珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R为：
[0009] THAI-F :5' -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3' ；
[0010] THAI-R :5,-CTTGGATCTGCACCTCTG-3,；
[0011] 扩增0 -珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R为：
[0012] HPFH-F :5' -TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3,；
[0013] HPFH-R :5'-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3,；
[0014] 扩增e-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R为：
[0015] DBT-F:5' -GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3,；
[0016] DBT-R:5,-ACCACATCCCTAACACAAC-3,；
[0017] 扩增a-珠蛋白基因簇中Ql区段等位基因的引物Al-F和Al-R为： 阳0化]Al-F:5, -GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3,；
[0019] Al-R:5,-CACGTTTGCTGAGGGAAA-3,；
[0020] 所述特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的巧光探针THAI-Prob为：
[0021] THAI-Prob:5, -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-B册-2-3,；
[0022] 所述特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的巧光探针HPFH-Prob为：
[0023] HPFH-Prob:5' -6-FAM-TGTTTGCCTGCTTTAAGTTCCAGACCT-B册-2-3';
[0024] 所述的特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的巧光探针DBT-Prob为： 阳0巧]DBT-Prob:5, -ROX-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-B册-2-3,；
[0026] 所述的特异性检测Al-F和Al-R扩增产物的巧光探针Al-Prob为：
[0027] Al-Prob: 5，-HEX-ACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTA-B册-2-3，。
[0028] 本发明所述的巧光探针中，FAM指簇基巧光素，肥X指六氯-6-甲基巧光素，ROX指 簇基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5,B册-2是指巧光泽灭基团。
[0029] 本发明所述的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶 液、MgClz和dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体 系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液。当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaq DNAPolymerase时，缓冲液则优选为与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。
[0030] 采用上述试剂盒快速检测一THAI、HP即-SEA和DBT的方法，包括W下步骤： 阳03U 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板； 阳〇3引。配制反应体系，具体为：
[0033] 将引物THAI-F、THAI-R、HPFH-F、HPFH-R、DBT-F、DBT-R、Al-F和A1-R，探针 THAI-Prob、HPFH-Prob、DBT-Prob和Al-Prob;W及PCR缓冲液、酶液、MgC12、dNTP、水和DNA 模板配制成反应体系；
[0034] 3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的巧 光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可W反映所检测模板数的多 少）；
[0035] 4)数据分析及结果判定：根据实时巧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果；内参基因为Al,若肥X通道显示有Cq值，则代表该样本正常扩增。具体判定如下：
[0036] 在肥X通道显示有Cq值前提下，当CY5通道有Cq值读数时，则表示该样本携 带-THAI等位基因.
[0037] 在肥X通道显示有Cq值前提下，当FAM通道有Cq值读数时，则表示该样本携带 HPFH-SEA等位基因；
[0038] 在肥X通道显示有Cq值前提下，当ROX通道有读数时，则表示该样本携带DBT等 位基因； W39] 仅有肥X通道显示有Cq值，其余通道无Cq值，则表示该样本不携带一THAI、 HPFH-SEA和DBT等位基因；
[0040] 在极少数基因型的情况下Al是没有扩增产物的，如基因型等，运需要再进 一步地分析。
[0041] 上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA:1~化g/ 化；各引物：〇. 3~0. 5ymol/L;各巧光探针浓度为0. 3~0. 5ymol/L;DNA模板：20~ 2(K)ng;儀离子：1. 5~1. 9mmol/L;反应体系的终体积优选为20yL。 阳0创上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95°C预变性8~12分钟，然后95°C15~ 30秒，60°C退火50~70秒，39~49个循环，于60°C退火步骤末采集巧光信号。
[0043]与现有技术相比，本发明的特点在于： W44] 1、本发明所述试剂盒可W实现单管单次反应完成一THAI、HPFH-SEA和DBT运3种 罕见缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，W及较高 的特异性。
[0045] 2、本发明所述试剂盒基于溶解法进行检测时无需开管操作，极大限度地降低实验 室PCR产物污染的可能；另一方面，采用溶解曲线分析法，该方法是目前使用实时巧光定量 PCR仪中最廉价的实验体系构建方法，成本更低也更易于推广。
【附图说明】
[0046] 图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；
[0047] 图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线； W48] 图3为本发明实施例1中3#样本的扩增曲线； W例 图4为本发明实施例1中4#样本的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，W更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于W下实施例。
[0051] 实施例1 :采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
[0052] 1、试剂盒的组成：
[0053] (1)扩增a-珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的引物对THAI-F和 THAI-R：
[0054] THAI-F:5, -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3'(SEQIDNO:1); 阳化5] THAI-R:5, -CTTGGATCTGCACCTCTG-3'（SEQIDNO:2);
[0056] (2)扩增HPFH-SEA等位基因的特征序列的引物对HPFH-F和HPFH-R:
[0057] HPFH-F:5'-TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3'（SEQIDNO:3);
[0058] HPFH-R:5, -AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3,（SEQIDNO:4);
[0059] (3)扩增0 -珠蛋白基因簇中DBT等位基因征序列的引物对DBT-F和DBT-R:
[0060] DBT-F:5, -GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3,（SEQIDNO:5);
[0061] DBT-R:5, -ACCACATCCCTAACACAAC-3,（SEQIDNO:6); 阳06引 （4)扩增a-珠蛋白基因簇中a1等位基因区段特征序列的引物对Al-F和Al-R:
[0063] Al-F:5' -GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3'（沈QIDNO:7);
[0064] Al-R:5, -CACGTTTGCTGAGGGAAA-3'（SEQIDNO:8); 阳0化]所述aI等位基因区段特征序列为：
[0066] Ctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtg gccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaat aaa邑tct邑a邑t邑邑邑C邑邑Ca邑CCt邑t邑