人类胰脂肪酶活性的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及临床检验领域中的试样中的人类膜脂肪酶活性的测定方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类膜脂肪酶作为急性膜腺炎等膜脏疾病的诊断标志物是重要的，对血清中的酶 活性进行测定的试剂W临床检验药的形式市售。该酶活性测定时的最佳氨离子指数（pH) 根据所使用的底物或反应条件的不同而不同，但据报告大致为7. 5至10的范围（例如参见 非专利文献1)。作为人类膜脂肪酶的酶学特征，可W举出：在包含底物的乳液或胶束的界 面产生反应；酶的活化需要胆汁酸和被称为辅脂酶的分子量为约IlkDa的蛋白质。在不存 在胆汁酸和辅脂酶时，膜脂肪酶的活性中屯、被称作盖子（Iid)的结构域覆盖，无法与底物 接触。胆汁酸对于乳液或胶束的形成有影响，进而，由于辅脂酶的存在，人类膜脂肪酶的立 体结构发生变化，从而使底物能够结合在人类膜脂肪酶的活性中屯、，进而使人类膜脂肪酶 显示出活性。如此，已知人类膜脂肪酶在包含疏水性的底物、胆汁酸盐、W及辅脂酶的复合 体的界面处发挥作用。
[0003] W往，在试样中的人类膜脂肪酶的活性测定中，作为其底物，使用甘油=脂。甘油 =脂W所谓乳液的形态进行使用，该乳液是通过与阿拉伯胶或聚乙締醇等进行强制揽拌而 在缓冲液中乳化分散来形成的。在使用甘油=脂底物测定脂肪酶活性时，例如利用碱滴定 法对于通过脂肪酶反应生成的脂肪酸进行定量。此外还尝试通过酶法对于经脂肪酶反应从 甘油=脂底物中游离出的脂肪酸进行测定，但由于甘油=脂底物具有乳液所致的强浊度， 因而难W使用酶共辆体系进行脂肪酶活性的分光学测定。此外还具有乳液底物由于保存而 容易产生相分离的缺点，难W再现性良好地对脂肪酶活性进行测定。为了解决运种使用甘 油=脂底物的方法中的课题，开发出了在底物中使用甘油二醋的方法（例如参见专利文献 1、2)、使用合成底物的方法（例如参见非专利文献2)，运些方法目前在日常检査法中使用。
[0004] 作为在底物中使用甘油二醋的优点，可W举出：由于其亲水性高于甘油S脂，因而 通过与表面活性剂组合，使得底物变得澄清，具有能够适应于通用的自动分析装置的便利 性。
[0005] 作为甘油二醋底物，主要使用1，2-甘油二醋。已知1，2-甘油二醋通过分子内醋键 的转移反应而转变成1，3-甘油二醋，在使用时要尽量不出现该变化。还有人提出将1，2-甘 油二醋的一部分转换为1，3-甘油二醋，将该混合物W液态进行稳定化，将其作为人类膜脂 肪酶测定的底物使用（例如参见专利文献3)。此处，有报告指出，使用甘油二醋底物的测定 方法会受到脂蛋白脂肪酶W及肝脂肪酶等非膜脂肪酶的影响。此外有报告指出，在使用甘 油二醋底物的测定方法中，由于受到血液中的脂蛋白脂肪酶等非膜脂肪酶或醋酶的影响， 因而具有针对膜脂肪酶的特异性容易降低等弊病（例如参见专利文献4)。人类的脂蛋白脂 肪酶、肝脂肪酶等非膜脂肪酶在肝素的作用下释放到血中。因此，在施与肝素的待测物中， 无法准确测定血中的膜脂肪酶活性。另一方面，在使用了合成底物的人类膜脂肪酶活性测 定用日常检査试剂中，据信不会受到脂蛋白酶、肝脂肪酶等非膜脂肪酶的影响（例如参见 非专利文献2)，但在作为脂肪酶的最佳pH的弱碱性区域合成底物难W具有稳定性。
[0006] 作为避免非膜脂肪酶的影响的方法，有报告指出，在底物中使用作为甘油二醋的 1，2-二亚油酷甘油的脂肪酶活性测定用市售试剂盒中，通过将作为胆汁酸盐使用的脱氧胆 酸钢置换为甘氨胆酸钢而降低了非膜脂肪酶的影响（例如参见非专利文献3)，但其详细内 容不明确。此外，不仅在底物中使用甘油二醋的脂肪酶活性的测定方法中会受到非膜脂肪 酶的影响，而且在底物中使用甘油=脂的脂肪酶活性的测定方法中也会受到非膜脂肪酶的 影响，在运种情况下，也有人报告可通过将脱氧胆酸变换为甘氨胆酸来避免非膜脂肪酶的 影响（例如参见非专利文献4)。但是，如上所述，甘油=脂底物具有无法进行分光学测定和 由于保存而容易产生相分离的缺点，因而难W再现性良好地测定脂肪酶活性。
[0007] 现有技术文献 [000引专利文献
[0009] 专利文献1 :日本特开昭59-91898号公报（日本专利第1607890号公报）
[0010] 专利文献2 :日本特开昭63-245672号公报
[0011] 专利文献3 :日本专利第4836196号公报
[0012] 专利文献4 :日本特开2008-307048号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 1:ClinicalQiemistry, 39 :p746_756, 1993
[0015] 非专利文献2 :医学薬学（医学与药学），41卷3号，P489-496,1999
[0016] 非专利文献 3:ClinicalChemistry, 38 :288-292, 1992
[0017] 非专利文献 4:ClinicalChemistry, 35 :pl688-1693, 1989
[0018] 非专利文献 5 :Ag;ri州huralBiologyandQiemistry, 44 (2), 399-406, 1980
【发明内容】
[0019] 发明所要解决的课题
[0020] 对于在底物中使用甘油二醋来测定试样中的人类膜脂肪酶活性的测定方法来说， 尽管与使用甘油=脂的测定方法相比在再现性方面优异，然而相对来说其容易受到脂蛋白 脂肪酶或肝脂肪酶的影响。从而，需要有在底物中使用甘油二醋、但避免了运些的影响且针 对膜脂肪酶的特异性更高的人类膜脂肪酶活性的测定方法。
[0021] 解决课题的手段
[0022] 如上所述，人类膜脂肪酶活性在测定时的最佳抑通常根据所用的底物或反应条 件的不同而不同，但据报告大致为7. 5至10的范围。本发明人进行了深入研究，结果发现， 在底物中使用甘油二醋对试样中的人类膜脂肪酶的活性进行测定时，通过将人类膜脂肪酶 的活性呈最大值的pH向酸性侧移动，在比W往报告更低的抑条件下使胆汁酸和辅脂酶共 存，进行人类膜脂肪酶反应，从而能够令人意外地降低由于施与肝素等而混合存在于试样 中的脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等非膜脂肪酶的影响。
[0023] 目P，本发明设及一种可降低非膜脂肪酶的影响的人类膜脂肪酶活性的测定方法， 其特征在于，通过将特定的结合型胆汁酸单独使用、或与其他胆汁酸组合使用，从而能将人 类膜脂肪酶的活性呈最大值的抑设定为小于7. 7,进而能在pH7. 4W下对试样中的人类膜 脂肪酶活性进行测定。
[0024] 需要说明的是，"结合型胆汁酸"是指在胆汁酸上结合有例如甘氨酸或者牛横酸等 氨基酸的物质，"非结合型胆汁酸"是指结合型胆汁酸W外的胆汁酸。此外，"最佳抑"是指 膜脂肪酶活性最大时的测定抑。
[0025] 本发明的方式为试样中的人类膜脂肪酶活性的测定方法，其包括下述工序：1)接 触工序，使胆汁酸、甘油二醋化及辅脂酶与试样在抑7.4W下进行接触，所述胆汁酸使得 人类膜脂肪酶的活性呈最大值的抑小于7. 7 ;W及2)检测工序，对于根据试样中的人类膜 脂肪酶活性而变化的信号量进行检测；使得人类膜脂肪酶的活性呈最大值的抑小于7. 7的 胆汁酸为含有下述a)和/或b)的胆汁酸：a)选自由甘氨脱氧胆酸（GDCA)、甘氨碟脱氧胆 酸（GCDCA)、牛横脱氧胆酸仰CA)、牛横碟脱氧胆酸（TCDCA)和它们的盐组成的组中的1种 或2种W上的a型胆汁酸；b)选自由甘氨胆酸（GCA)、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA)、牛横胆酸 (TCA)、牛横熊脱氧胆酸（TUDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的b-1型胆汁酸 与选自由脱氧胆酸值CA)、碟脱氧胆酸（CDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的 b-2型胆汁酸的组合。
[0026] 例如，在对人类膜脂肪酶的活性相对于抑进行作图的情况下，在向上方绘制凸 曲线的情况下，活性的最大值意味着活性的峰值。此外，在通常的条件下，相对于"最佳 pH"(其指的是人类膜脂肪酶活性为最大时的测定pH)，有时也将存在上述胆汁酸时人类膜 脂肪酶活性为最大时的测定抑称为"表观最佳抑"。
[0027] 例如，在接触工序中，在使用a型胆汁酸的情况下，a型胆汁酸的添加比例相对于 全部的胆汁酸和/或其盐的总量为40%W上。
[0028] 非离子表面活性剂可W与甘油二醋一起存在。非离子表面活性剂例如为选自由聚 氧乙締烷基酸、聚氧乙締烷基苯基酸W及聚氧乙締仲醇酸组成的组中的至少1种。
[0029] 例如，在检测工序中使用比色法。此外，例如在接触工序中，全部胆汁酸的浓度W 摩尔比计相对于甘油二醋为10倍W上。进而，例如在接触工序中抑为7. 2W下。
[0030] 本发明的构成的一例如下。
[0031] (1)
[0032] -种试样中的人类膜脂肪酶活性的测定方法，该测定方法包括下述工序：
[0033] 1)接触工序，使胆汁酸、甘油二醋W及辅脂酶与上述试样在抑7.4W下进行接 触，所述胆汁酸使得上述人类膜脂肪酶的活性呈最大值的抑小于7. 7 ;W及
[0034] 2)检测工序，对于根据上述试样中的上述人类膜脂肪酶活性而变化的信号量进行 检测；
[0035] 其中，上述胆汁酸为含有下述a)和/或b)的胆汁酸：
[0036] a)选自由甘氨脱氧胆酸（GDCA)、甘氨碟脱氧胆酸（GCDCA)、牛横脱氧胆酸（TDCA)、 牛横碟脱氧胆酸（TCDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的a型胆汁酸；
[0037] b)选自由甘氨胆酸（GCA)、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA)、牛横胆酸（TCA)、牛横熊脱氧 胆酸（TUDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的b-1型胆汁酸与选自由脱氧胆酸 值CA)、碟脱氧胆酸（CDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的b-2型胆汁酸的组 合。
[0038] 似
[0039] 如（1)所述的测定方法，其中，上述试样为可能混合存在有人类非膜脂肪酶的试 样、或者为可W包含人类非膜脂肪酶的试样。
[0040] (3)
[0041] 如（1)或（2)所述的测定方法，其中，在上述接触工序中，使用上述a)的胆汁酸。
[0042] (4)
[004引如（1)至做的任一项所述的测定方法，其中，在使用上述a)的胆汁酸的情况下， 上述a型胆汁酸相对于全部胆汁酸和/或其盐的总量的添加比例为40%W上。
[0044] (5)
[004引如（1)或似所述的测定方法，其中，在上述接触工序中，使用上述b)的胆汁酸。
[0046] (6)
[0047] 如（1)至（4)的任一项所述的测定方法，其中，上述a型胆汁酸为选自甘氨脱氧胆 酸（GDCA)及其盐中的1种或2种。
[004引（7)
[0049] 如（1)至（4)的任一项所述的测定方法，其中，上述a型胆汁酸为选自由甘氨脱氧 胆酸（GDCA)、牛横脱氧胆酸（TDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上。
[0050] 做
[005。 如（1)至（4)的任一项所述的测定方法，其中，上述a型胆汁酸为选自牛横脱氧胆 酸灯DCA)及其盐中的1种或2种。
[0052] (9)
[0053] 如（1)至（8)的任一项所述的测定方法，其中，与上述甘油二醋一起存在有非离子 表面活性剂。
[0054] (10)
[005引如（9)所述的测定方法，其中，上述非离子表面活性剂为选自由聚氧乙締烷基酸、 聚氧乙締烷基苯基酸W及聚氧乙締仲醇酸组成的组中的至少1种。
[0056] (11)
[0057] 如（1)至（10)的任一项所述的测定方法，其中，在上述检测工序中使用比色法。
[0058] (12)
[005引如（1)至（11)的任一项所述的测定方法，其中，在上述接触工序中，全部胆汁酸的 浓度W摩尔比计相对于上述甘油二醋为10倍W上。
[0060] (13)
[006。 如（1)至的任一项所述的测定方法，其中，在上述接触工序中，抑为7. 2W 下。
[0062] (14)
[0063] 一种试样中的人类膜脂肪酶活性的测定用试剂盒，其至少包含胆汁酸、甘油二醋 W及辅脂酶，所述胆汁酸使得人类膜脂肪酶的活性呈最大值的抑小于7. 7;其中，
[0064] 该试剂盒是按照上述人类膜脂肪酶活性测定时的抑为7. 4W下的方式来制备 的；
[0065] 上述胆汁酸为含有下述a)和/或b)的胆汁酸：
[0066]a)选自由甘氨脱氧胆酸（GDCA)、甘氨碟脱氧胆酸（GCDCA)、牛横脱氧胆酸（TDCA)、 牛横碟脱氧胆酸（TCDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的a型胆汁酸；
[0067] b)选自由甘氨胆酸（GCA)、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA)、牛横胆酸（TCA)、牛横熊脱氧 胆酸（TUDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的b-1型胆汁酸与选自由脱氧胆酸 值CA)、碟脱氧胆酸（CDCA)和它们的盐组成的组中的1种或2种W上的b-2型胆汁酸的组 厶 1=1O
[0068] (15)
[0069] 如（14)所述的试剂盒，其中，上述试样为可能混合存在有人类非膜脂肪酶的试 样、或者为可W包含人类非膜脂肪酶的试样。
[0070] (16)
[007。 如（14)或（巧）所述的试剂盒，其中，该试剂盒进一步包含色原体。
[0072] (17)
[007引如（14)至（16)所述的试剂盒，其中，该试剂盒被制备成活性测定时的抑为7. 2W下。
[0074] (18)
[007引如（14)至（17)的任一项所述的试剂盒，其中，内容物被分到2个W上的容器中进 行保存。
[0076] (19)
[0077] -种试样中的人类膜脂肪酶活性的测定方法，该测定方法包括下述工序：
[0078] 1)接触工序，使胆汁酸、甘油二醋W及辅脂酶与上述试样在抑7.4W下进行接 触；W及
[0079] 2)检测工序，对于根据上述试样中的上述人类膜脂肪酶活性而变化的信号量进行 检测；
[0080] 其中，上述甘油二醋的浓度为0. 35~2. 5mmol/l、上述胆汁酸的浓度W摩尔比计 为上述甘油二醋的浓度的10~20倍；
[0081] 上述胆汁酸为下述a)和/或b)的胆汁酸：
[0082]a)含有a型胆汁酸的胆汁酸，该a型胆汁酸选自由甘氨脱氧胆酸（GDCA)、甘氨碟 脱氧胆酸（GCDCA)、牛横脱氧胆酸（TDCA)、牛横碟脱氧胆酸（TCDCA)和它们的盐组成的组 中的1种或2种W上，上述a型胆汁酸相对于全部的胆汁酸和/或其盐的总量的摩尔比为 40%W上；
[008引 b)含有b-1型胆汁酸与b-2型胆汁酸的组合的胆汁酸，该b-1型胆汁酸选自由甘 氨胆酸（GCA)、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA)、牛横胆酸（TCA)、牛横熊脱氧胆酸（T