在培养期间减少乳酸累积的方法和生产多肽的方法
【技术领域】 [0001] 。
[0002] 本发明设及减少细胞培养物中的乳酸累积的方法，所述方法包括将二价过渡金属 盐添加至细胞培养物的步骤。本发明还设及生产多肤的方法，所述方法包括将二价过渡金 属盐添加至细胞培养基W减少乳酸累积，W及使多肤发酵和回收多肤的步骤。更具体地，本 发明设及使细胞在细胞培养系统中生长的方法，所述细胞培养系统减少培养基中的乳酸累 积。
【背景技术】
[0003] 动物细胞培养技术广泛应用于生物医药研究和制药工业。评估细胞生长和代谢活 动是成功控制和改进细胞培养过程的关键。最常用的两种被监测代谢产物是葡萄糖和乳 酸。葡萄糖作为大部分培养基配方的主要碳源和重要的能量来源。葡萄糖进入糖酵解途径 导致形成丙酬酸作为终产物。在动物细胞中，丙酬酸可W穿梭于TCA循环中或被转化成乳 酸。由于葡萄糖转变为丙酬酸的高通量W及糖酵解和TCA循环之间的低效结合，导致在连 续细胞培养中易于发生乳酸累积。积聚的乳酸转而导致培养环境的酸化。此外，即使在控 制K1的情况下，乳酸本身也可能对哺乳动物细胞产生毒性。乳酸的积累往往是细胞培养过 程的关键限制因素，特别是当细胞密度高时。
[0004] 在生物制药生产中，由于简单和可靠的测量及其在培养基中的化学稳定性，监测 葡萄糖和乳酸已成为日常操作。更重要的是，葡萄糖浓度用于评估能量，而乳酸作为代谢副 产物累积的重要参数和培养环境恶化的指标。在生物反应器操作中，作为重要的培养参数， 葡萄糖和乳酸测量通常是设计过程控制，比如进料或灌注策略，的关键部分。
[0005] 在过去，对葡萄糖和乳酸代谢与细胞密度的相关性做了很大努力。葡萄糖的消耗 速率和乳酸的累积速率反映培养的细胞的代谢活性。
[0006] 如之前所述，有毒副产物，如乳酸，的积累对细胞生长和抗体的生产有抑制作用。 过量的乳酸积聚可W导致培养基的渗透压的增加，或在不控制抑的情况下，导致培养PH下 降。乳酸的主要负面影响是由乳酸分泌至培养基中引起的抑值的降低造成的。
[0007] 美国专利号6156570教导用于培养细胞优选哺乳动物细胞的、使乳酸累积量最小 化的方法。
[0008] 美国专利号7429491教导在动物细胞培养中将有限的葡萄糖用于分批补料培养 的提高蛋白质产量的方法。
[0009] 在过去，已经尝试降低乳酸水平，主要通过A]补充并保持非常低水平的葡萄糖； 或B]利用分子生物技术的细胞代谢工程。
[0010] 本发明掲示了添加二价过渡金属盐(铜，锋）和乳酸累积之间的相关性W及减少乳 酸累积的可能途径。
【发明内容】
[0011] 因此，本发明设及减少细胞培养物中的乳酸的累积的方法，所述方法包括将二价 过渡金属盐加入细胞培养物中的步骤；W及生产多肤的方法，所述方法包括W下步骤：a) 将二价过渡金属盐加入细胞培养物中W减少乳酸累积；W及b)使多肤发酵并回收多肤。
【附图说明】
[0012] 图1A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0013] 图1B展示了存在锋盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0014] 图2A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0015] 图2B展示了存在锋盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0016] 图3展示了存在锋盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0017] 图4A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0018] 图4B展示了存在锋盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0019] 图5A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0020] 图5B展示了存在锋盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0021] 图6展示了存在儀盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
[0022] 图7展示了存在锋盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
【具体实施方式】
[0023] 本发明设及一种减少细胞培养物中的乳酸累积的方法，所述方法包括将二价过渡 金属盐加入细胞培养物的步骤。
[0024] 在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐具有选自铜和锋的金属。
[00巧]在本发明的实施例中，铜盐为硫酸铜，并且锋盐为硫酸锋。
[00%] 在本发明的另一实施例中，所述细胞从哺乳动物细胞系获得。
[0027] 在本发明的另一实施例中，所述哺乳动物细胞系选自中国仓鼠卵巢（CH0)细胞、 NS0 (非分泌型0)和BHK(幼仑鼠肾)。
[0028] 在本发明的另一实施例中，添加约0. 2mM至约0. 4mM的浓度范围的所述二价过渡 金属离子。
[0029] 在本发明的另一实施例中，所述培养在选择W下的系统中进行，包括，但不限于： 分批补料培养、分批培养、摇瓶和生物反应器。
[0030] 在本发明的另一实施例中，乳酸水平累积量减少约5%至约40% 本发明也设及生产多肤的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐加入细胞培养物W减 少乳酸累积，W及使多肤发酵并且回收多肤的步骤。
[0031] 在本发明的另一实施例中，所述细胞从哺乳动物细胞系获得。
[0032] 在本发明的另一实施例中，所述哺乳动物细胞系选择W下细胞系，包括，但不限 于：中国仓鼠卵巢（C册）细胞、NS0和BHK。
[0033] 在本发明的另一实施例中，所述二价过渡金属盐具有选自铜和锋的金属。
[0034] 在本发明的另一实施例中，铜盐为硫酸铜，并且锋盐为硫酸锋。
[0035] 在本发明的另一实施例中，添加约0. 2mM至约0. 4mM浓度范围的所述盐。
[0036] 在本发明的另一实施例中，所述多肤选自W下抗体，包括但不限于：抗VEGF-A抗 体、抗化r-2抗体、抗CD6抗体，和抗TNF抗体。
[0037] 在本发明的另一实施例中，所述培养过程在选择W下任一系统中进行，包括，但不 限于：分批补料培养、分批培养、摇瓶和生物反应器。
[0038] 在本发明的另一实施例中，本发明设及利用改进的细胞培养方法降低乳酸累积量 的方法，所述改进的细胞培养方法包括细胞生长阶段和多肤生产阶段。
[0039] 因此，本发明提供一种借助例如单克隆抗体来生产多肤的方法，该方法可W减少 乳酸累积量。 W40] 进一步地，本发明描述减少的乳酸累积量的范围为从约5%至约40%。
[0041] 本发明设及通过减少乳酸累积的过程来生产单克隆抗体的方法。
[0042] 在本发明的实施例中，其中乳酸累积量的下低通常与标准生产程序相关。
[0043] 在本发明的另一实施例中，描述了在分批补料培养系统中添加二价过渡金属盐降 低乳酸累积的方法。
[0044] 在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐包括铜盐和锋盐。 W45] 在本发明的另一实施例中，培养基中所用的锋盐和铜盐的浓度为约0. 4mM。
[0046] 在本发明的另一实施例中，铜的二价过渡金属盐为硫酸铜，而锋的金属盐为硫酸 锋。
[0047] 在本发明的另一实施例中，所述二价过渡金属盐的浓度是指该盐在培养基中的浓 度。
[0048] 在本发明的另一实施例中，运些锋和铜金属离子是参与糖酵解&TCA途径的酶活 性所需的，因此，添加运些离子可改进使大部分葡萄糖完全氧化的细胞的总代谢效率，从而 减少乳酸累积。
[0049] 在本发明的另一实施例中，所述培养基为限定化学成分培养基，所述限定化学成 分培养基包括，但不限于HyCloneCDM4NS0和HyCloneCDM4M油。
[0050] 在本发明的另一实施例中，所述哺乳动物细胞选自如下细胞，包括，但不限于：中 国仓鼠卵巢（CH0)细胞、非分泌型0 (NS0)和幼仑鼠肾（BHK)。
[0051] 在本发明的另一实施例中，所述多肤选自W下抗体，包括但不限于：抗VEGF-A抗 体、抗化r-2抗体、抗CD6抗体，和抗TNF抗体。 W52] 在本发明的另一实施例中，用设备YSI7100MBS分析仪（YSI7100MBS Analyzer)分析培养基中的乳酸水平。
[005引在本发明的另一实施例中，乳酸累积的减少使培养性能，如总PH维持、细胞维持， 总体更好。所述二价过渡金属盐的添加，例如锋盐/铜盐，使乳酸累积减少，并且还维持培 养基的PH。
[0054] 在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐还可W限定为二价固定金属离子。
[0055] 在本发明的另一实施例中，本发明还设及改进生产蛋白质的方法，例如，蛋白质的 大规模商业生产，例如，抗体生产。
[0056] 在本发明的另一实施例中，本发明还设及使细胞在细胞培养系统中生长的方法， 所述细胞培养系统减少培养基中的乳酸累积。
[0057] 在本发明的另一实施例中，添加二价过渡金属盐，即，锋盐/铜盐进一步使乳酸累 积量减少约5%至约40%。 阳0郎]术语定义 在本发明的描述中，可w使用下列术语，其定义在此描述。
[0059] 术语"抗体"包括抗体或抗体衍生物，或其片段，并且抗体的说明也适用于本发明 的抗体的制备。在抗体的片段中，功能相当或同源