用于增强肝细胞功能的细胞培养基的制作方法
【专利说明】用于増强肝细胞功能的细胞培养基
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119,要求2012年11月28日提交的美国临时申请系列第 61/730762号的优先权，本文W该申请为基础并将其全文通过引用结合于此。 柳的]领域
[0004] 本发明设及细胞培养基、特别是用于培养肝细胞化巧atocyte)或肝脏细胞 (livercell)的细胞培养基，及其使用方法。
【背景技术】 阳0化]药物诱导的肝损伤是从市场召回药物的主要原因之一，占约30%的从市场召回药 物。当下，准确地预测药物诱导的肝损伤仍然是药物开发的主要挑战。在被批准用于临床 试验之前，通常在各种体外肝脏细胞模型例如原代肝细胞（PHH)和肝脏细胞系中测试备选 药物的药物诱导肝损伤。尽管PHH目前用作药物诱导的肝损伤研究的"黄金标准"，但难W 在体外保持P皿的功能。例如，P皿的一些关键肝功能例如I/II期药物代谢酶活性，在培 养中最初的24-48小时之内降低约50%。此外，供体-与-供体的差异和有限的供应使 P皿不能用于早期药物毒性研究，例如高通量筛选（HT巧。相对于P皿，肝脏细胞系具有一些 优势。例如，肝脏细胞系通常可大量供应且传代培养不受限，易于操控和适于高通量筛选。 但是，肝脏细胞系相对于PHH也有一些不足，例如低得多的药物代谢酶水平。因为肝细胞 的活力和功能很大程度上取决于它们的培养条件，所W极其需要改善细胞培养基来支持 高功能的肝细胞。
[0006] 在体内，肝细胞的存活、增殖、分化和代谢功能受到各种可溶因子的高度调节。把 肝细胞从肝组织分离之后，就损失了运些可溶因子。分离时，原代肝细胞进入去分化状态 并逐渐失去其大多数的功能。经过几十年的研究，已确定和表征了一些维持肝细胞功能的 可溶因子，例如膜岛素、肝细胞生长因子、激素等。运些可溶因子通过不同的机制例如信号 转导路径、细胞周期控制等调控肝细胞功能。把运些可溶因子添加到细胞培养基显著改善 了肝细胞的活力和功能。但是，甚至当培养基中存在运些可溶因子时，也不能完全恢复肝细 胞的体内功能。
[0007] 可通过小分子化学物调控培养的原代肝细胞的功能。例如，CYP3A4的表达和功能 可通过蛋白激酶A活化剂增强，但可被蛋白激酶C活化剂抑制。因此，能模仿人类体内可溶 因子调节功能和能增强总体肝细胞功能的任何小分子化学物都有可能被用作细胞培养基 中的组分。虽然已提出蛋白质激酶A(PKA)抑制剂可用于细胞培养基来促进原代人类肝细 胞生长，但没有关于包含小分子PKA抑制剂W增强肝细胞功能的培养基的报道。
[0008] 已显示细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制剂增强HepG2细胞中包括CYP2B6和 UGT1A1的多种肝酶的表达，但在化册人类肝胚细胞瘤化巧atoblastoma)细胞中不能增 强（苏加塔尼（Sugatani)等，《药物代谢和分布值rugMet油olismandDisposition)》 38:177-186, 2010)，但没有掲示用作增强总体肝功能的试剂。
【发明内容】
[0009] 其中，本发明描述能增强培养物中细胞总体药物代谢功能的化合物、组合物和方 法。例如，在含如本文所述的化合物特别是LFM-A13和结构上相关化合物的培养基中培养 肝细胞或肝脏细胞系，可使广泛多种药物代谢酶的表达增加。如本文所述，已发现已报道 为有力的布拉通度urton)酪氨酸激酶度TK)抑制剂的LFM-A13在培养的肝细胞中诱导药 物代谢酶例如细胞色素P450 (CY巧酶的广泛表达。此外，LFM-A13和结构上相关化合物还 可增强其它肝功能。令人惊讶的是，测试了结构式不相关的BTK抑制剂，但没有得到类似于 LFM-A13的结果。
[0010] 在本文所述的实施方式中，细胞培养组合物可包括LFM-A13或结构上相关的化合 物。组合物可用来增强培养的肝脏细胞的总体代谢功能，W维持培养的肝脏细胞的肝功 能，或用来使干细胞分化成肝细胞。因此，运种细胞培养组合物可用于培育用于药物开发 的高功能人类肝脏细胞。恢复或维持较高的药物代谢功能可得到更好的基于细胞的模型， 从而改善对药物诱导的肝损伤的预测。
[0011] 本领域的技术人员在结合附图阅读W下详述内容的基础上，很容易看出本文所述 各种实施方式中的一种或多种实施方式相比于细胞培养组合物和方法的现有方法的优点。
[0012] 附图简要说明
[0013] 图1是条形图，显示来氣米特（LE巧、来氣米特代谢物（LFM)和来氣米特代谢物类 似物A13(LMF-A13)相对于对照（仅培养基）对培养的原代人类肝细胞中CYP3A4或CYP1A2 活性的影响。
[0014]图2是条形图，显示来氣米特（LF)、来氣米特代谢物（LFM)和来氣米特代谢物类似 物A13(LMF-A13)相对于对照（仅培养基）对培养的肝脏细胞系化epaRG和康宁（Corning) 肝脏细胞系）中CYP3A4活性的影响。
[0015] 图3是条形图，显示来氣米特代谢物类似物A13(LMF-A13)相对于对照（仅培养 基）对在五种不同肝细胞培养基中培养的原代人类肝细胞中CYP3A4活性的影响。
[0016] 图4是条形图，显示来氣米特（LE巧、来氣米特代谢物（LFM)和来氣米特代谢物 类似物A13(LMF-A13)相对于对照（仅培养基）对培养的原代人类肝细胞中基础和利福平 (RI巧诱导的CYP3A4活性的影响。 阳017]图5A-B是图表，显示各种浓度的来氣米特代谢物类似物A13 (LMF-A13)对培养的 原代人类肝细胞中基础和奥美拉挫（omeprazole)诱导的CYP1A2活性（A)和基础和利福平 (rifampin)诱导的CYP3A4活性度）的影响。
[0018] 图6是条形图，显示来氣米特（LE巧、来氣米特代谢物（LFM)和来氣米特代谢物 类似物A13 (LMF-A13)相对于对照对培养的原代人类肝细胞中各种药物代谢酶和肝蛋白的 mRNA水平的影响。对于各mRNA，结果根据下述顺序提供：对照，LEF，LFM，LFM-A13。
[0019] 图7是条形图，显示来氣米特代谢物类似物A13 (LMF-A13)相对于对照对用于培养 的原代人类肝细胞中各种药物代谢酶和肝蛋白的mRNA水平的影响。对于各mRNA，结果根据 下述顺序提供：对照，LFM-A13。
[0020] 图8是条形图，显示针对布拉通度urton'S)酪氨酸激酶度TK)和类化1〇激酶 1 (PLK2)，PLK3,和PLK4的shRNA对培养的原代人类肝细胞中CYP3A4酶活性的影响。
[0021] 图9显示在存在或不存在LFM-A13时从培养的人类胚胎干细胞化ESC)衍生的巧 光染色的肝细胞的图像。细胞核用4'，6-二脉基-2-苯基吗I噪二盐酸盐值API)染色，其为 干细胞的标志物；白蛋白（ALB)，其为肝前体标志物；多药物抗性相关蛋白2(MRP2),其为 肝功能标志物。
[0022]图10是条形图，显示LFM-A13对培养的干细胞衍生的肝细胞中的基础和利福平诱 导的CYPA4活性的影响。
[002引图11是条形图，显示当细胞在含有或不含有Matrigel?覆盖层（M0L)的胶原被覆 的板（C0L)上培养时，分化成肝细胞或前体的hESC中mRNA表达的实时PCR分析：ALB是白 蛋白，AFP是甲胎蛋白，CYP3A4是细胞色素P4503A4,CYP7A1是细胞色素P4507A1，和PGCla 是过氧化物酶体增殖物活化的受体-丫 -共活化因子-1a。
[0024]发明详述
[00巧]在W下详述和实施例中，参照构成说明书的一部分的附图，附图中通过示例显示 几个具体实验的示例结果，其显示本文所述的化合物、组合物和方法的效果。应理解，能够 设想并做出其它实施方式而不偏离本发明的范围或精神。因此，W下发明详述和实施例不 应理解为限制性的。
[00%] 除非另外说明，本文使用的所有科学和技术术语的含义是本领域通用的含义。本 文所提供的定义用于促进理解本文中常用的某些术语，且无意于限制本发明的范围。
[0027] 在本说明书和权利要求书中所用的单数形式"一个"，"一种"和"该（所述）"包括 具有多个指示物的实施方式，除非上下文中有明显的表示。
[0028] 除非另有明确说明，如本文的说明书和所附权利要求所使用，术语"或"一般包括 "和/或"的意思。
[0029] 如本文所使用，"干细胞"是能连续的分裂（自我更新），并且能分化成多样的特化 细胞的细胞。在一些实施方式中，干细胞是能够从对象的器官或组织分离的多能、全能或多 能性干细胞。运些细胞能够得到完全分化的或者成熟的细胞种类。干细胞可W是源自骨髓 的干细胞、间充质干细胞（MSC)、类似的或者为神经元干细胞或者胚胎干细胞。干细胞可W 是选自上皮和脂肪组织、厮带血、肝、脑或其他器官的多谱系细胞。在各种实施方式中，所述 干细胞是多能性干细胞，例如从哺乳动物分离的多能性胚胎干细胞。合适的哺乳动物可W 包括晒齿类动物，例如小鼠或大鼠，灵长类动物，包括人类和人类W外的灵长类动物。
[0030] 已经建立的人胚胎干细胞系的例子包括但不限于化，H7,H9,H13或 化4(可得自威斯康辛大学OJniversityofWisconsin)建立的WiCell)(汤普 森（Thompson) (1998)Science282:1145) ;hESBGN-01，hESBGN-02，hESBGN-03(布 勒萨基因有限公司度resaGen,Inc.)，美国佐治亚州埃瑟（Athens,GA));肥S-1, 肥S-2,肥S-3,肥S-4,肥S-5,肥S-6 (得自新加坡的ES细胞国际有限公司巧SCell International,Inc. ,Singapore));服F-1,服F-6 (得自美国圣弗朗西斯科的加利福尼 亚大学扣DiversityofCalifornia，SanFrancisco))；I3,1 3.2,1 3.3,1 4,1 6,1 6. 2,J3,J3. 2(源自W色列海法的W色列科技研究所（Technion-IsraelInstitute ofTechnology,化ifa,Israel)) ;UCSF-1 和UCSF-2 (吉纳己斯夫（Genbacev)等人，费 绳尔（Fertil)