工程化W表达本文件中列举的任何酶的一种或者多中 (例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多种）重组形式的任何属和种的宿主细胞。如 此，例如，宿主细胞可含有外源核酸，其编码催化本文中描述的任何途径的一个或者多个步 骤的酶。
[0165] 另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与 [acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
[0166] 此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的（时-对映异构体的情况下， 存在与底物的（S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
[0167] 本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酷 基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是 泛宿主性的（promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高 特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同 的酶种类。
[0168] 在一些实施方案中，本文中概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法 的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解 度、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。 阳169] 在一些实施方案中，可W将本文概述的途径中的酶经由附加型或者染色体整合方 法基因给予（即，通过在宿主生物体中具有多个拷贝的基因来过表达）至所得的遗传修饰 的生物体中。
[0170] 在一些实施方案中，可W利用基因组级别（genome-scale)系统生物学技术如通 量平衡分析来设计用于将碳流量引导至C7结构单元的基因组级别的弱化或者敲除策略。 阳171] 弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组（双交叉方法）、诱变、酶抑制剂和 RNA干扰巧NA。。 阳172] 在一些实施方案中，可W利用通量组（fluxomic)、代谢物组（met油olomic)和转 录物组（transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将 碳流量导向C7结构单元中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。 阳173] 在一些实施方案中，宿主微生物的对高浓度的C7结构单元的耐受性可W通过在 选择性环境中的连续培养来改善。
[0174] 在一些实施方案中，可W弱化或增强宿主微生物的内源生物化学网络W保证 2-氧代戊二酸的细胞内可用度，（2)创造NAD+的不平衡，其仅可W通过C7结构单元的形成 来平衡，（3)阻止通向和包括C7结构单元的中屯、代谢产物或中屯、前体的降解，和/或（4)保 证从细胞的高效流出。 阳1巧]在一些需要2-氧代戊二酸细胞内可用度的实施方案中，可W在宿主中过表达阳P簇激酶或阳P簇化酶，来产生回补碳通量到通向2-氧代戊二酸的克雷布斯循环（Krebs 巧cle)中（Schwartz等，2009,Proteomics, 9, 5132 - 5142)。
[0176] 在一些需要2-氧代戊二酸细胞内可用度的实施方案中，可W在宿主中过表达丙 酬酸簇化酶，来产生回补碳通量到通向2-氧代戊二酸的克雷布斯循环中（Schwartz等， 2009,Proteomics, 9, 5132 - 5142) 〇 阳177] 在一些需要2-氧代戊二酸细胞内可用度的实施方案中，可W在宿主中过表达PEP 合酶，来提高从丙酬酸通向阳P的通量，因此增加通过阳P簇激酶或阳P簇化酶进入克雷布 斯循环中的碳通量（Schwartz等，2009,Proteomics, 9, 5132 - 5142)。
[0178] 在一些实施方案中在宿主微生物使用通过内消旋-2, 6-二氨基庚二酸的赖氨酸 生物合成途径的情况下，编码从2-氧代戊二酸合成2-氧代己二酸的基因被基因给予到所 述宿主中。
[0179] 在一些实施方案中在宿主微生物使用通过2-氧代己二酸的赖氨酸生物合成途径 的情况下，编码通过内消旋-2, 6-二氨基庚二酸的赖氨酸合成的基因基因被给予到所述宿 主中。
[0180] 在一些阻止C7结构单元合成期间形成的NADH降解为副产品的实施方案中，弱化 编码催化丙酬酸降解为乳酸的酶例如乳酸脱氨酶的内源基因，例如IdM(化en等，Appl. 化viron. Microbiol.，2011，77巧），2905-2915)。 阳181] 在一些阻止C7结构单元合成期间形成的NADH降解为副产品的实施方案中，弱化 编码催化憐酸締醇丙酬酸降解为班巧酸的酶，例如甲基糞酿（menaquinol)-延胡索酸氧化 还原酶的内源基因，例如化地C(见，例如化en等，2011，见上文）。 阳182] 在一些阻止C7结构单元合成期间形成的NADH降解为副产品的实施方案中，弱化 编码催化乙酷-CoA降解为乙醇的酶的内源性基因，例如由a化E编码的醇脱氨酶（化en等， 2011，见上文）。 阳183] 在一些实施方案中，弱化编码催化丙酬酸降解为乙醇的酶例如丙酬酸脱簇酶的内 源基因。
[0184] 在一些实施方案中，弱化编码催化异下醇的生成的酶例如2-酬酸脱簇酶的内源 性基因。 阳185] 在一些实施方案中，当途径需要过量的NAD+辅助因子用于C7结构单元合成时，可 W在宿主生物中弱化编码甲酸脱氨酶的基因（化en等，2011，见上文）。 阳186] 在一些实施方案中，弱化促进NADPH转化为NADH的内源性酶，例如归类于，例如EC 1. 4. 1. 4下的NADPH-特异性谷氨酸脱氨酶。
[0187] 在一些实施方案中，可W弱化归类于，例如EC1.6. 1.1、EC1.6. 1.2或EC 1. 6. 1. 3下的转氨酶。
[0188] 在一些实施方案中，弱化编码使用NADH和NADPH两者作为辅助因子的谷氨酸脱氨 酶巧C1.4. 1.3)的内源基因。 阳189] 在一些使用天然积累聚径基链烧酸醋的宿主的实施方案中，可W在所述宿主菌株 中弱化编码聚合物合酶的内源性基因。 阳190] 在一些实施方案中，可W在宿主中过表达k丙氨酸脱氨酶，来从丙酬酸再生k丙 氨酸，作为《 -转氨酶反应的氨基供体。 阳191] 在一些实施方案中，可W在宿主中过表达NADH特异性k谷氨酸脱氨酶，来从 2-氧代戊二酸再生k谷氨酸，作为《 -转氨酶反应的氨基供体。
[0192] 在一些实施方案中，可W弱化降解通向和包括C7结构单元的中屯、代谢产物和 中屯、前体的酶，例如归类于例如EC1. 3. 8. 62下的庚二酷-CoA脱氨酶；归类于例如EC1.3. 8.7或EC1.3. 8.1下的酷基-CoA脱氨酶；和/或归类于例如EC1.3. 8. 6下的戊二 酷-CoA脱氨酶。 阳193] 在一些实施方案中，可W弱化通过辅酶A醋化激活C7结构单元的内源性酶，例如 CoA-连接酶，例如归类于，例如EC6. 2. 1. 14下的庚二酷-CoA合成酶。
[0194] 在一些实施方案中，C7结构单元穿过细胞膜流出到细胞外基质可W通过对细胞膜 遗传工程化结构修饰，或增加与C7结构单元相关的任意转运体的活性来提高或放大。
[0195] 庚二胺的流出可W通过过表达广泛底物范围多药物转运体来提高或放大，例如 来自枯草芽抱杆菌的Bit(Woolridge等，1997,J.Biol.Chem.，272(14) :8864 - 8866);来 自大肠杆菌的Ac巧和AcrD(E化ins&N化aido, 2002,J.Bacteriol.，184 (23)，6490 - 6499) 或来自金黄色酿脈葡萄球菌的NorA(Ng等，1994,AntimicrobAgents Qiemother, 38(6), 1345 - 1355)或来自枯草芽抱杆菌的BmHNeyfaldi, 1992,Antimicrob AgentsQiemother, 36 (2), 484 - 48f5)。 阳196] 7-氨基庚酸和庚二胺的流出可W通过过表达可溶性转运体来提高或放大，例如来 自于谷氨酸棒状杆菌的lysE转运体度ellmann等，2001,Microbiology, 147, 1765 - 1774)。 阳197] 庚二酸的流出可W通过过表达二簇酸转运体来提高或放大，例如来自于谷氨酸棒 状杆菌的SucE转运体（Huhn等，Appl.Microbiol. &Biotech.，89 (2)，327 - 335)。 阳19引使用重组宿主生产C7结构单元
[0199]通常，可W通过提供宿主微生物并且用含有如上文描述的合适碳源的培养基 培养提供的微生物生成一种或多种C7结构单元。一般地，培养基和/或培养条件可W 使得微生物生长至足够的密度，并且有效生成C7结构单元。对于大规模生产工艺，可 W使用任何方法，诸如那些在别处描述的（ManualofIndustrialMicrobiologyand Biotechnology, 2ndEdition,Editors:A.L.DemainandJ.E.Davies,ASMPress；和 PrinciplesofFermentationTechnology,P.F.StanburyandA.Whitaker,Pergamon)。简 言之，用特定的微生物接种含有合适培养基的大罐（例如，100加仑，200加仑，500加仑，或 更大的罐）。在接种后，溫育微生物W容许生成生物量。一旦达到期望的生物量，可W将含 有微生物的培养液转移到第二个罐。此第二个罐可W是任何大小。例如，第二个罐可W比/ 与第一个罐大、小或相同大小。通常，第二个罐大于第一个，从而可W对来自第一个罐的培 养液添加额外的培养基。另外，此第二个罐内的培养基可W与第一个罐中使用的培养基相 同或不同。 阳200] -旦转移，可W溫育微生物W容许生成C7结构单元。一旦生成，可W使用任何方 法来分离C7结构单元。例如，可W经由吸附方法从发酵液选择性回收C7结构单元。在庚 二酸和7-氨基庚酸的情况中，所得的洗脱液可W经由蒸发进一步浓缩，经由蒸发和/或冷 却结晶来结晶，并且经由离屯、回收晶体。在庚亚甲基二胺和1，7-庚二醇的情况中，可W采 用蒸馈来实现期望的产物纯度。 阳201] 本发明在W下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发 明范围。 实施例 阳202] 实施例1 :硫醋酶使用庚二酷-CoA作为底物并形成庚二酸的酶活性 阳20引编码N端化S标签的序列加到来自于大肠杆菌的编码硫醋酶的tesB基因（SEQID NO1，见图7)，使得可W产生N端HIS标记的硫醋酶。所述修饰的tesB基因克隆到祀T1化 表达载体中，在T7启动子的控制下。所述表达载体转化到化21巧E3]大肠杆菌宿主中。所 得的重组大肠杆菌菌株在含有50血Luria化oth(LB)培养基和抗生素选择压力的500血 摇瓶中在37°C培养，在23化pm下振荡。所述培养物使用0. 5mMIPTG在17°C诱导过夜。 阳204] 通过离屯、从所述诱导的摇瓶培养物收获团粒。所述团粒重悬并裂解于Y-per?溶 液中（ThermoScientific,Rockford,IL)。通过离屯、将细胞碎片从上清分离。使用化-亲和 层析从所述上清纯化硫醋酶，洗出液通过超滤进行缓冲液交换并浓缩。 阳205] 酶活性试验W-式S份在由50mM憐酸盐缓冲液（抑=7. 4)、0.ImMEllman'S试剂 和667yM的庚二酷-CoA(作为底物）组成的缓冲液中进行。通过向所述含有庚二酷-CoA的试验缓冲液中加入0. 8yMtesB基因产物起始酶活性试验反应，并在37°C解育20分钟。 辅酶A的释放通过在412nm处的吸光度来监控。从活性酶试验的吸光度减去与只有底物的 对照相关的吸光度，所述对照含有经煮沸的酶，并与空载体对照比较。tesB基因产物接受庚 二酷-CoA作为底物通过相对分光光度法确定（见图8)，并合成庚二酸作为反应产物。 阳206] 实施例2:使用庚二酸半醒作为底物并且形成7-氨基庚酸的《 -转氨酶的酶活性 阳207] 将编码N-末端化S标签的序列添加至分别编码SEQIDN0:8、10、ll和13的转 氨酶的来自紫色色杆菌、下香假单胞菌、球形红杆菌、和河流弧菌的基因（参见图7)，使得 可W产生N-末端有HIS标签的转氨酶。将每种所得的经修饰基因在T7启动子的控制 下克隆入祀T21a表达载体中，并且将每种表达载体转化入化21巧E3]大肠杆菌宿主中。于 37°C在含有50mLLB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在W23化pm摇动的 情况中培养所得的重组大肠杆菌菌株。使用ImMIPTG于16°C诱导每种培养物过夜。 阳20引经由离屯、收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒，并经由超声 处理裂解。经由离屯、分开细胞碎片与上清液，并且立即在酶活性测定法中使用无细胞提取 物。 阳209] 在缓冲液中实施逆向（即7-氨基庚酸至庚二酸半醒）的酶活性测定法，所述缓冲 液由终浓度50mM肥PES缓冲液（pH= 7. 5)、lOmM7-氨基庚酸、lOmM丙酬酸和100yM化唉 (pyridoxyl)5'憐酸盐组成。通过添加转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物 到含有7-氨基庚酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在W250巧m摇动的情况下 于5°C溫育4小时。经由RP-HPLC量化从丙酬酸形成k丙氨酸。
[0210] 每种没有7-氨基庚酸的仅酶对照表明丙酬酸至k丙氨酸的低基线转化。参见图 14。沈QIDNO8、沈QIDNO10、沈QIDNO11和沈QIDNO13的基因产物接受7-氨基 庚酸作为底物，如相对于空载体对照确认的。参见图15。 悦11] 对沈QIDNO10、沈QIDNO11和沈QIDNO13的转氨酶确认正向（即庚二酸 半醒至7-氨基庚酸）的酶反应。在缓冲液中实施酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM肥阳S缓冲液（pH= 7. 5)、lOmM庚二酸半醒、lOmMk丙氨酸和100yM化唉5'憐酸盐组 成。通过添加转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物到含有庚二酸半醒的测定 缓冲液启动每个酶活性测定反应，并在W25化pm摇动的情况下于25°C溫育4小时。经由 RP-HPLC量化丙酬酸的形成。 阳21引 沈QIDNO10、沈QIDNO11和沈QIDNO13的基因产物接受庚二酸半醒作为 底物，如相对于空载体对照确认的。参见图16。确认转氨酶活性的可逆性，证明了SEQ IDNO8、沈QIDNO10、沈QIDNO11、和沈QIDNO13的转氨酶接受庚二酸半醒作 为底物，并且合成7-氨基庚酸作为反应产物。
[0213] 实施例3 :簇酸还原酶使用庚二酸作为底物并形成庚二酸半醒的酶活性
[0214] 将编码HIS标签的序列添加至分别编码SEQIDN0:4和7的簇酸还原酶的来自 Se即iliparusrugosus和Se即iliparusrotundus的基因（参见图7)，使得可W生成N-末 端有HIS标签的簇酸还原酶。将每种经修饰的基因与编码有HIS标签的来自枯草芽抱杆菌 的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶一起（两者都在T7启动子下）克隆入祀TDuet表达载体中。 将每种表达载体转化入化21巧E3]大肠杆菌宿主，并且于37°C在含有50mLLB培养基和抗 生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在W23化pm摇动的情况中培养所得的重组大肠杆菌 菌株。使用自身诱导培养基于37°C诱导每种培养物过夜。
[0215] 经由离屯、收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重选每个团粒，并经由超声 处理裂解，并经由离屯、分开细胞碎片与上清液。使用Ni-亲和层析从上清液中纯化簇酸还 原酶和憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶，W10倍稀释入50mM肥PES缓冲液（pH= 7. 5)中，并 经由超滤浓缩。
[0216] 在缓冲液中一式=份实施酶活性测定法（即从庚二酸盐至庚二酸半醒），所述缓 冲液由终浓度50mM肥阳S缓冲液（pH= 7. 5)、2mM庚二酸、lOmMMgClzUmMATP和ImM NADPH组成。通过添加纯化的簇酸还原酶和憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶基因产物或空载体 对照至含有庚二酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后于室溫溫育20分钟。通过 于340nm的吸光度监测NADPH的消耗。每种没有庚二酸的仅酶对照表明NADPH的低基线消 耗。参见图9。
[0217]SEQIDNO4和SEQIDNO7的基因产物（得到S巧的基因产物增强）接受庚二 酸作为底物，如相对于空载体对照确认的（参见图10)，并且合成庚二酸半醒。
[0218] 实施例4 :簇酸还原酶使用7-径基庚酸作为底物并形成7-径基庚醒的酶活性 阳219] 将编码His标签的序列添加至分别编码SEQIDN0:2-7的簇酸还原酶的来自 海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparus rugosus、耻垢分枝杆菌、马赛分枝杆菌、和Segniliparus rotun化S的基因（参见图7)，使得可W生成N-末端有HIS标签的簇酸还原 酶。将每种经修饰的基因与编码有化S标签的来自枯草芽抱杆菌的憐酸泛酷琉基乙胺基转 移酶一起（两者都在T7启动子下）克隆入祀T Duet表达载体中。
[0220] 将每种表达载体转化入化21巧E3]大肠杆菌宿主中，并于37°C在含有50mLLB培 养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中在W23化pm摇动的情况中培养所得的重组 大肠杆菌菌株。使用自身诱导培养基于37°C诱导每种培养物过夜。 阳221] 经由离屯、收获来自每种经诱导的摇瓶培养物的团粒。重选每个团粒，并经由超声 处理裂解。经由离屯、分开细胞碎片与上清液。使用Ni-亲和层析从上清液中纯化簇酸还原 酶和