使用hla标志物测定母体血液中的胎儿dna的分数的方法
【专利说明】使用HLA标志物测定母体血液中的胎儿DNA的分数的方法
[0001] 1997年在母体血液中发现无细胞胎儿DNA已经开启了非侵袭性产前诊断和筛 选的新领域。循环胎儿DNA的用途包括化组基因分型W及筛选非整倍性和单基因疾 病，综述于Jiang,P.,等K但FetalQuant: deducing fractional fetal DNA concentration from massively parallel sequencing of DNA in maternal plasma， Bioin化rmatics28:2883。此类诊断应用需要母体循环中存在的总DNA内的胎儿DNA的 分数（也被称为"胎儿分数"）的知识。对于一些应用，运将是仅仅质量控制问题。例如， 由CLIA实验室提供的一些目前的商业非侵袭性产前诊断（NIPD)测试表明，如果母体血浆 中的DNA的<4%是胎儿的，则测试结果将是无法得出结论的，所W不运行测试。对于其他应 用，诸如非整倍性和隐性等位基因的拷贝数的检测，胎儿分数的精确测定是必需的。
[0002] 目前定量母体血浆中的胎儿DNA的方法设及检测Y染色体基因座（例如，SRY 或DYS14,美国专利号6, 258, 540);检测胎儿表观遗传标志物（例如，基因乳腺丝抑蛋白、 RASSF1A和沈RPINB2的甲基化模式，综述于H址n,S.，等人，（2011) acids as potential markers for preeclampsia,Placenta, 32:sl7);或希望发现可 区分母本DNA与胎儿DNA的有信息的单核巧酸多态性（SNP)，而祀向大量的染色体基因座 (美国申请系列号12/644, 388)。基于Y-染色体的方法的明显缺点是其不适用于女性胎儿。 由于缺乏可重复性，表观遗传方法是不佳的。使用多个SNP的方法（例如，Jiang,等人，同 上）在整个基因组寻找有信息的SNP中需要复杂数学分析。测定胎儿分数的更可预测且精 确的方式是期望的。
[000引发明概述 本发明是测定样品中胎儿核酸的分数的方法，其包括：定量检测所述样品中的至少一 种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因； 使用上述检测的量，测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述测定步骤包 括计算步骤中测定的所述非母本HLA等位基因的量与所有HLA等位基因的量的总和的比率 的2倍。在一些实施方案中，所述至少一种非母本和母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、 HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、D地 1、DPA1 和DPB1 等位基因、或HLA-A，外显子 2 和 3;HLA-B，外显子2和3;HLA-C，外显子2和3;DQA1，外显子2;D地1，外显子2和3;DPA1， 外显子2 ;DPB1，外显子2 ;DRB1，外显子2 ;DRB3,外显子2 ;DRB4,外显子2 ;和DRB5,外显子 2或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在一 些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括W下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序 和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引 物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序 之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方 案中，所述HLA等位基因通过包括W下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，W获 得HLA扩增子；进行克隆测序W测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种 母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的 数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括W下 计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对 应于已知HLA等位基因的多个箱化ins);将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因； 将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步 骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位 基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序 (sequencingbysynthesis)。在一些实施方案中，在两个、S个或更多个基因座（例如， DPBUD地1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基 因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、S个或更多个基 因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括 数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括W下的方法定 量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因； 测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积 的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所 述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在 一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方 的基因型信息。
[0004] 在又另一个实施方案中，本发明是检测胎儿中的染色体异常的方法，其包括：提供 来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；通过包括W下的方法测定所述样品中的胎儿核酸的 分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因，定量检测所述样品中在相同 基因座的至少一种母本HLA等位基因，比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定 所述样品中胎儿核酸的浓度；定量检测所述样品中的来自怀疑异常的至少一个染色体的基 因座；确定先前步骤中检测的染色体基因座是否W相对于第二步骤中测定的胎儿DNA的浓 度的异常量存在，从而检测染色体异常。在该实施方案的变型中，所述至少一种非母本HLA 等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、D地1、DPA1 和DPB1 等 位基因，包括HLA-A，外显子2和3 ;HLA-B，外显子2和3 ;HLA-C，外显子2和3 ;DQA1，外显 子2 ;D地1，外显子2和3 ;DPA1，外显子2 ;DPB1，外显子2 ;DRB1，外显子2 ;DRB3,外显子2 ; DRB4,外显子2 ;和DRB5,外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在该实 施方案的变型中，在两个、S个或更多个基因座（例如，来自基因DPBUD地1和DRB1)检测 在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中， 所述HLA等位基因通过包括W下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克 隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物 包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集 步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA 等位基因通过包括W下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，W获得HLA扩增子； 进行克隆测序W测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因 和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样 品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括W下计算步骤：将在所述HLA 基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的 多个箱化ins);将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数 序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中 鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在 一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序。在一些实施方案中，在两个、 S个或更多个基因座（例如，DPB1、D地1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等 位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同 时扩增在两个、=个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案 中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等 位基因通过包括W下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似 五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述 非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体 积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测 定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个 HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
[0005] 在又另一个实施方案中，本发明是通过确定患者血液中的胎儿分数是否超过阔值 水平而确定怀孕患者是否具有或可能发展先兆子痛的方法，其中通过包括W下的方法来测 定所述胎儿分数：提供来自患者的血液样品；定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA 等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母 本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中的胎儿分数。在该实施方案的变型中， 所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、 D地UDPA1和DPB1等位基因，例如，HLA-A，外显子2和3 ;HLA-B，外显子2和3 ;HLA-C，外显 子2和3 ;DQA1，外显子2 ;D地1，外显子2和3 ;DPA1，外显子2 ;DPB1，外显子2 ;DRB1，外显子 2 ;DRB3,外显子2 ;DRB4,外显子2 ;和DRB5,外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序 列的组合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括W下的方法定量检测：测序，具 体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正 向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述 方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕 获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括W下的方法定量检测：用正向引物和反 向引物扩增，W获得HLA扩增子；进行克隆测序W测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因 座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA 序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤 包括W下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列 分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱化ins);将一个或两个多数序列鉴定为母本等位 基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比 较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等 位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测 序。在一些实施方案中，在两个、S个或更多个基因座（例如，DPB1、D地1和DRB1)检测在 相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在 相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、S个或更多个基因座的所述非母本和母本 HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。 在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括W下的方法定量检测：将所述样品分成多 个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA 等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座 的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。 在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进 一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
[0006] 在本实施方案的又另一个变型中，本发明是通过经由上文所述的方