交换蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种植物耐逆性化+化0/H+交换蛋白及其编码基 因与应用，特别涉及一种与植物耐盐和耐低钟性相关的大豆化+化+)/H+交换蛋白GmNcl1及 其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] ±壤中高浓度的盐分对作物造成渗透胁迫和离子毒害，盐分胁迫影响着植物产 量、蛋白质合成和光合作用W及能量代谢，从而影响作物的生长，严重导致作物减产。全世 界至少有20%耕地盐溃化，我国各种盐溃±壤资源总面积约达9913万公顷，大部分位于大 豆主产区。±壤次生盐碱化日趋严重，次生盐碱地的面积逐渐增加。因此，提高农作物的耐 盐能力，对于扩大可耕地面积，增加和稳定作物产量，具有重要的意义。大豆是一种中度耐 盐的作物，解析大豆耐盐胁迫反应的机制，不仅对于植物生物学本身的理论研究意义重大， 而且对于耐盐育种及提高大豆抗胁迫能力的转基因策略具有重要的指导意义。
[0003] 离子胁迫和渗透胁迫是高盐毒害的两个主要方面，维持细胞内无机离子的平衡对 于提高植物的耐盐能力有着很重要的作用，无机离子也是植物细胞渗透调节的重要物质， 能维持细胞的渗透压。造成植物盐害的主要离子是化+，而r是重要的渗透调节组分，在盐 碱±地或含盐量较高的±壤中生长的作物往往承受着双毒害作用：化+的毒害和r的亏缺。 植物对盐胁迫形成一系列生理机制，主要包括化+的外排、化+的区隔化和限制化+向叶片运 输等，送些机制都需要化+〇〇 /H+交换蛋白的参与。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与植物耐逆性相关的蛋白质及其编码基因与应用。
[000引本发明所提供的蛋白质，名称为GmNcll，来源于大豆（Glycinemax(L. )Me;r;r.)品 种铁丰8号，是如下（a)或化）：
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] 化）将（a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的蛋白质。
[000引为了便于GmNcll蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋 白质的氨基末端或駿基末端连接上如下表所示的标签。
[000引表；柄;签的序列
[0010]
[0011]
[0012] 上述化）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述化）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0013] 编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0014] 所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可W 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0015] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述GmNcll蛋白的基因（命 名为GmNcll);所述GmNcll基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[001引 1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[001引 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%W上同源性且编码所述GmNcll蛋白的DNA分子。
[0019] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0020] 其中，序列2由2520个核巧酸组成，第1-2520位为0RF，编码序列表中序列1所示 的GmNcll蛋白。
[0021] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
[0022] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、 PBI121、地inl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达 载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与mRNA加 工或基因表达的DNA片段。所述聚腺巧酸信号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的3'端。使 用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核巧酸前可加上任何一种增强型、组成型、 组织特异型或诱导型启动子，例如花挪菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛素基因化iquitin 启动子（P化i)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合 使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，送些增强子区域可W是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与 编码序列的阅读框相同，W保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性 的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接w逆境 筛选转化植株。
[0024] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述GmNcll基因转录的启动子具体为35S 启动子。
[0025] 更为具体的，所述重组表达载体为如下（I)或（II):
[0026] (I)在地1121载体的酶切位点中插入所述GmNcll基因得到的重组质粒。所述酶 切位点具体为甜aI和化0I。
[0027] (II)在PCAMBIA3300载体的酶切位点中插入所述GmNcll基因得到的重组质粒。 所述酶切位点具体为甜aI和BamHI。
[002引所述表达盒由能够启动所述GmNcll基因表达的启动子，所述GmNcll基因，W及转 录终止序列组成。
[0029] 所述GmNcll蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如 下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0030](a1)调控植物的耐逆性；
[0031](曰2)选育耐逆性增强的植物品种。
[0032] 在本发明中，所述调控植物的耐逆性具体体现在；在所述植物体内，若所述 GmNcll基因的表达量越高，则所述植物的耐逆性越强。
[0033] 在本发明中，所述选育耐逆性增强的植物品种的方法，具体可包括将所述GmNcll 基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0034] 本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性增强的转基因植物的方法。
[0035] 本发明所提供的培育耐逆性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
[0036]a)向目的植物中导入所述GmNcll蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转 基因植物；
[0037]b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，耐逆性增强的转基因 植物。
[0038] 所述GmNcll蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述 GmNcll蛋白的基因（即GmNcll基因）是所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0039] 1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
[0040] 2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述GmNcll蛋白的DNA 分子；
[00川 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%W上同源性且编码所述GmNcll蛋白的 DNA分子。
[0042] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0043] 所述GmNcll基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中， 也可通过最小化线性转化元件（如；WpCAMBIA3300-GmNcll载体为模板通过巢式PCR方 法扩增得到包括T-DNA右边界序列+35S启动子+序列2+N0S终止子+T-DNA左边界序列的 DNA片段）导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、化质粒、 植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所 述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0044] 在上述应用或方法中，所述耐逆性为如下中的至少一种；耐盐性、耐低钟。
[0045]进一步，所述盐可为 100-200mM化C1，如 100-125mM化C1、125-175mM化C1 或